黃玲,丁艷,郁金紅,張永臣,方安寧,嚴(yán)家來

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院＆南京市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京市公共衛(wèi)生醫(yī)療中心,南京 210003;2.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;b.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,合肥 230601)

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)是高發(fā)病率和高致死率癌癥,我國約占全球50%以上的新發(fā)病例和死亡病例,其中肝細(xì)胞癌(HCC)約占PHC的84%～92%[1]。因缺乏靈敏、特異的篩查及診斷標(biāo)志物,且治療方法和療效有限,患者的總體預(yù)后差[2]。多項(xiàng)研究[3-4]報(bào)道,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),尤其血漿中穩(wěn)定表達(dá)的環(huán)狀RNA (circular RNA,circRNA)被證實(shí)參與了肝癌發(fā)生、發(fā)展過程[5],可能成為新一代的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn),目前已廣泛用于人類疾病診斷、治療、組織發(fā)育鑒定等各方面研究。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明,來源于磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白β基因(PITPNB)的hsa_circ_0003056(又稱為circPITPNB, hsa_circRNA_103191)在肝癌組織中呈差異表達(dá)[6],并建立了絕對(duì)定量檢測(cè)血漿hsa_circ_0003056表達(dá)水平的方法[7]。本研究擬進(jìn)一步用該方法檢測(cè)過表達(dá)和敲減hsa_circ_0003056對(duì)HepG2、sk-hep-1肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,以期為臨床診斷和治療PHC提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系、儀器與試劑 HepG2、sk-hep-1肝癌細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存。hsa_circ_0003056過表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空載體pLC5-ciR由廣州吉賽生物科技公司構(gòu)建,hsa_circ_0003056慢病毒敲減干擾載體(pGMLV-SC5 RNAi)及其對(duì)照空載體(NC)由吉滿生物科技(上海)公司構(gòu)建。Opti-MEM和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司),MTT試劑(美國Sigma公司),CCK-8試劑、Transwell試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)板、matriGel膠(美國BD公司),Trypsin-EDTA消化液、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC)/PI和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)公司)。BD Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司),KHB-ST-360酶標(biāo)儀 (上?？迫A生物工程公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取HepG2、sk-hep-1肝癌細(xì)胞系置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí),根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞系,試驗(yàn)設(shè)置以下4組:過表達(dá)空載體對(duì)照組(pLC5),hsa_circ_0003056過表達(dá)組(C3056),敲減空載體對(duì)照組(NC),hsa_circ_0003056敲減組(shRNA)。轉(zhuǎn)染步驟:(1)轉(zhuǎn)染前日,取5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),使轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞融合度達(dá)70%～90%。(2)在100 μL無血清培養(yǎng)基中加入3 μg質(zhì)粒/5 μL siRNA(終濃度50 nmol/L),柔和混勻。(3)用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋4 μL Lipofectamine 2000試劑,輕柔混勻,室溫靜置5 min。(4)將稀釋好的質(zhì)粒/siRNA與Lipofectamine 2000試劑混合,輕柔混勻,室溫靜置20 min,將200 μL質(zhì)粒/siRNA-Lipofectamine復(fù)合物加入至含800 μL無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞板中,輕柔振蕩細(xì)胞培養(yǎng)板。(5)細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 h,吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)功能試驗(yàn)。

1.2.2CCK-8 法檢測(cè)的細(xì)胞增殖 取1.2.1中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞,置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(含2 000個(gè)細(xì)胞),按照CCK-8試劑及KHB-ST-360酶標(biāo)儀說明書操作檢測(cè)培養(yǎng)1、2、3 d時(shí)的吸光度(A450 nm)值,并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式:增殖率(同一樣本)=第n天A450 nm值/第0天平均A450 nm值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式:抑制率(同一時(shí)間點(diǎn))=1-實(shí)驗(yàn)組增殖率/對(duì)照組平均增殖率。

1.2.3Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取1.2.1中轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,1 500 r/min離心5 min,用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL, 以100 μL/孔的細(xì)胞密度加入至Transwell小室的上室,在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育24 h。取出小室,用棉簽擦去上室的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定15 min,清洗后結(jié)晶紫染色10 min,光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿過細(xì)胞數(shù)。

1.2.4Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 4 ℃溶解Matrigel基質(zhì)膠過夜,用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1∶3的體積比稀釋,取40 μL Matrigel基質(zhì)膠,加入至預(yù)冷的Transwell試驗(yàn)小室中,37 ℃溫育2 h使基質(zhì)膠凝固。吸棄小室中多余的液體,并在上室、下室分別加入100 μL和600 μL無血清培養(yǎng)基,37 ℃平衡過夜。取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,1 500 r/min離心5 min,無血清DMEM培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞,用100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸,加入至Transwell試驗(yàn)小室的上室,在下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基。溫育24 h后,取出小室,用棉簽拭去上室的細(xì)胞。4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌,結(jié)晶紫染色10 min,PBS洗滌,光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,收集1×106個(gè)細(xì)胞。檢測(cè)步驟:(1)細(xì)胞固定:1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞,棄上清,用預(yù)冷PBS洗滌2次,加入預(yù)冷70%乙醇,置于4 ℃固定過夜。(2)細(xì)胞染色:離心并收集細(xì)胞,PBS洗滌,分別加入500 μL PBS,50 μg/mL溴化丙錠(PI),100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100試劑,4 ℃避光溫育30 min。(3)流式細(xì)胞分析:記錄激發(fā)波長488 nm處PI紅色熒光,計(jì)數(shù)2～3萬個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用ModFit細(xì)胞周期擬和軟件(美國 Verity Software House公司)分析。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 收集上述轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞, 1 500 r/min離心5 min,棄上清,用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),離心后棄上清,加入預(yù)冷的1×結(jié)合液,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL,取0.5 mL細(xì)胞懸液(5×105個(gè)),按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC)及BD Calibur流式細(xì)胞儀說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。結(jié)果判讀:活細(xì)胞(AnnexinV-/PI-);早期凋亡細(xì)胞(AnnexinV+/PI-);凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞 (AnnexinV+/PI+),最終凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果為早凋、晚凋及死細(xì)胞總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力 檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組(3.20±0.04)比較, hsa_circ_0003056過表達(dá)組在第3天時(shí)sk-hep-1細(xì)胞的增殖能力(3.53±0.04)顯著升高(t=10.63,P<0.01);而hsa_circ_0003056敲減組的增殖能力(2.90±0.03)顯著降低(t=19.82,P<0.01)。此外,與對(duì)照組(5.90±0.10)相比, hsa_circ_0003056過表達(dá)組在第3天時(shí)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖數(shù)(6.57±0.09)顯著升高(t=8.84,P<0.01),而hsa_circ_0003056敲減組(4.93±0.27)顯著降低(t=6.32,P<0.01)。見圖1。

注:A,sk-hep-1細(xì)胞生長曲線,B,HepG2細(xì)胞生長曲線;pLC5,過表達(dá)空載體對(duì)照;C3056,hsa_circ_0003056過表達(dá)質(zhì)粒;NC,shRNA對(duì)照;shRNA,hsa_circ_0003056敲減質(zhì)粒;a,與pLC5比較,P<0.05; b,與NC比較,P<0.05。

2.2hsa_circ_0003056促進(jìn)sk-hep-1和HepG2細(xì)胞遷移及侵襲能力 與pLC5對(duì)照組的遷移數(shù)[(217.67±6.51)個(gè)]和侵襲數(shù)[(165.67±3.79)個(gè)]比較,sk-hep-1細(xì)胞中hsa_circ_0003056過表達(dá)組的遷移數(shù)[(301.67±7.23)個(gè)]和侵襲數(shù)[(252.67±22.19)個(gè)]均顯著增加(t分別為14.95,6.70,P<0.01);與NC組的遷移數(shù)[(257±6.24)個(gè)]和侵襲數(shù)[(188±6.08)個(gè)]比較,敲減組的遷移數(shù)[(127.33±5.13)個(gè)]和侵襲數(shù)[(110.67±4.73)個(gè)]均顯著降低(t分別為27.79,17.39,P<0.01)。此外,與pLC5對(duì)照組的遷移數(shù)[(11.67±2.31)個(gè)]和侵襲數(shù)[(9.33±2.52)個(gè)]比較,sk-hep-1細(xì)胞中hsa_circ_0003056過表達(dá)組的遷移數(shù)[(26.67±8.96)個(gè)]和侵襲數(shù)[(15.67±2.89)個(gè)]均顯著增加(t分別為2.81,2.86,P<0.05);而與NC組的遷移數(shù)[(6.33±1.53)個(gè)]和侵襲數(shù)[(9.33±2.08)個(gè)]比較,敲減組的遷移數(shù)[(4.67±1.53)個(gè)]和侵襲數(shù)[(2.67±0.58)個(gè)]均顯著降低(t分別為1.34和5.35,P值分別為0.25和0.006)。見圖2。

注:A,Transwell試驗(yàn)檢測(cè)遷移及侵襲結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×200);B,細(xì)胞遷移及侵襲柱狀圖;pLC5,過表達(dá)空載體對(duì)照;C3056,hsa_circ_0003056過表達(dá)質(zhì)粒;NC,shRNA對(duì)照;shRNA,hsa_circ_0003056敲減質(zhì)粒;a,與pLC5比較,P<0.05;b,與NC比較,P<0.05。

2.3hsa_circ_0003056加快sk-hep-1和HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞增殖 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)和敲減hsa_circ_0003056后對(duì)sk-hep-1和HepG2細(xì)胞周期的結(jié)果表明,在sk-hep-1細(xì)胞中,過表達(dá)組(46.18%)相較對(duì)照組G1期細(xì)胞比率(54.64%)顯著降低,而干擾組(70.29%)較其對(duì)照組G1期細(xì)胞比率(56.93%)顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同樣,在HepG2細(xì)胞中,過表達(dá)組(43.2%)相較對(duì)照組G1期細(xì)胞比率(49.73%)顯著降低,干擾組(59%)較其對(duì)照組G1期細(xì)胞比率(50.63%)顯著增加,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4hsa_circ_0003056降低sk-hep-1和HepG2細(xì)胞凋亡水平 在sk-hep-1和HepG2細(xì)胞中過表達(dá)和敲減hsa_circ_0003056后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平結(jié)果表明,在sk-hep-1細(xì)胞中,過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率(3.42%)較對(duì)照組(7.24%)顯著降低,敲減組細(xì)胞凋亡率(10.87%)較其對(duì)照組(7.15%)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣,在HepG2細(xì)胞中,過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率(1.09%)較對(duì)照組(8.08%)顯著降低,敲減組細(xì)胞凋亡率(14.09%)較其對(duì)照組(9.92%)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:pLC5,過表達(dá)空載體對(duì)照;C3056,hsa_circ_0003056過表達(dá)質(zhì)粒;NC,shRNA對(duì)照;shRNA,hsa_circ_0003056敲減質(zhì)粒。

3 討論

繼miRNA及LncRNA之后,近年來circRNAs的功能及機(jī)制研究相對(duì)比較熱門。與線性的miRNA相比,circRNA除了具有較多的結(jié)合位點(diǎn)、較高的表達(dá)水平以及在外周血中穩(wěn)定表達(dá)外,其在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的臨床價(jià)值,具有潛在成為腫瘤標(biāo)志物的可能性[8]。在肝癌組織中差異表達(dá)的circRNA相對(duì)較少,有學(xué)者通過比較肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA譜,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005075可能成為肝細(xì)胞癌的一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,在肝癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[9]。另有研究證實(shí),肝癌組織中高表達(dá)的hsa_circ_PVT1[10]、hsa_circ_0001394[11]、circRNA-100338[12]、hsa_circRNA_104348[13]等與患者腫瘤大小、TNM分期、生存率及預(yù)后密切相關(guān)。此外,還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中呈低表達(dá)的circZKSCAN1[14]、CircMEMO1[15]等亦與疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本課題組通過前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)[6],與癌旁組織比較,環(huán)狀RNA hsa_circ_0003056在肝癌患者的腫瘤組織中呈低表達(dá),只有少數(shù)患者的該指標(biāo)變化不明顯;與體檢健康者比較,不同肝癌患者血漿中環(huán)狀RNA hsa_circ_0003056的表達(dá)水平存在較大的差異,但總體上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,hsa_circ_0003056上調(diào)組的預(yù)后與下調(diào)組差異不顯著,推測(cè)可能與納入的標(biāo)本個(gè)體差異性有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了hsa_circ_0003056在肝癌細(xì)胞系中的功能,結(jié)果證實(shí)過表達(dá)hsa_circ_0003056能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)可以加快細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞凋亡;而敲減hsa_circ_0003056可抑制細(xì)胞增殖、遷移侵襲,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測(cè)原因:(1)肝癌細(xì)胞中hsa_circ_0003056輕度升高,但肝癌組織中占40%的其他表達(dá)該分子且豐度高的成分如脂肪組織、膽管、枯否細(xì)胞(Kupffercells,KC)等被肝癌細(xì)胞相對(duì)抑制生長,造成肝癌組織的混合物中hsa_circ_0003056的表達(dá)水平總體呈下降趨勢(shì)。(2)進(jìn)行功能試驗(yàn)的肝癌細(xì)胞系與肝臟組織不同,細(xì)胞系中hsa_circ_0003056的表達(dá)豐度較低,與正常肝細(xì)胞系L02相比,hsa_circ_0003056在HepG2和sk-hep-1細(xì)胞系中均呈高表達(dá),而在低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L和Huh7細(xì)胞系呈低表達(dá),表明不同肝癌細(xì)胞系中hsa_circ_0003056的表達(dá)量也不同。此外,不同患者血漿中hsa_circ_0003056的表達(dá)水平也各不相同,表明肝癌的異質(zhì)性較大,患者外周血中該分子可能來源于不同組織,同一組織中不同細(xì)胞表達(dá)量也不同,臨床應(yīng)用hsa_circ_0003056進(jìn)行個(gè)體化診斷治療還有許多需要研究的地方。

根據(jù)ceRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)理論,circRNA的表達(dá)水平與目的基因呈正相關(guān),生物信息學(xué)GO和KEGG分析亦表明,hsa_circ_0003056可以通過靶向miR-211-5p/miR-204-5p/miR-9-3等“海綿”樣作用調(diào)節(jié)下游基因。推測(cè)hsa_circ_0003056與其母基因PITPNB之間可能存在競(jìng)爭抑制關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003056表達(dá)失調(diào),可能增加PHC侵襲及轉(zhuǎn)移,但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。綜上所述, hsa_circ_0003056可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系HepG2和sk-hep-1細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,加快細(xì)胞周期進(jìn)程,降低細(xì)胞凋亡。