趙高余,程敬偉,周妍妍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,北京 100050)

氣單胞菌(Aeromonasspp.)屬于弧菌科革蘭陰性桿菌,廣泛分布于環(huán)境中,對(duì)人類和水棲動(dòng)物、魚類均可致病,包含至少39個(gè)種,其中嗜水氣單胞菌、達(dá)卡氣單胞、豚鼠氣單胞菌和維氏氣單胞菌致病性較強(qiáng),易引起人類腸道感染,近年來(lái)已經(jīng)成為引起腹瀉的主要病原菌之一。如果治療不當(dāng),可以導(dǎo)致敗血癥[1]。

目前治療氣單胞菌屬引起的腹瀉首選喹諾酮類藥物。主要包括第一代喹諾酮類藥物萘啶酸(nalidixic, NAL)和第二代喹諾酮藥物如環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP),但有學(xué)者報(bào)道臨床分離株對(duì)上述藥物出現(xiàn)了不同程度的耐藥[2]。耐藥機(jī)制主要由染色體上喹諾酮類耐藥決定區(qū)(quinolone-resistance deter mining regions,QRDR)介導(dǎo)[3]和由質(zhì)粒上喹諾酮耐藥基因介導(dǎo)(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)介導(dǎo)[4-8]。本研究旨在通過(guò)對(duì)臨床腹瀉患者的分離株進(jìn)行相關(guān)研究,探討分離自腹瀉患者的氣單胞菌屬細(xì)菌的藥物敏感性特點(diǎn)和氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制,以期為臨床合理選用抗生素治療氣單胞菌提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2017年4月至10月北京友誼醫(yī)院住院患者和腸道門診腹瀉患者分離的氣單胞菌111株。經(jīng)多基因串聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)化分析分型方法(multilocus phylogenetic analysis, MLPA)[9]將氣單胞菌鑒定為維氏氣單胞菌(A.veronii)36株、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)47株、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)5株、A.aquariorum16株、腸棕氣單胞菌(A.enteropelogenes)2株、中間氣單胞菌(A.media)2株、圣雷利氣單胞菌(A.sanarellii)2株以及雙殼類氣單胞菌(A.bivalvium)1株[10]。

1.2儀器與試劑 Sensititre革蘭陰性菌藥敏板(美國(guó)Thermo Scientific公司),哥倫比亞血平板瓊脂(美國(guó)Oxoid公司),細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及PCR試劑(北京天根生化科技公司)。DNA Engine Dyad PCR基因擴(kuò)增儀、GELDoc2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.3藥敏試驗(yàn) 按照藥敏試劑說(shuō)明書操作, 先用無(wú)菌脫脂棉簽挑選氣單胞菌菌落于生理鹽水中研磨均勻并調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?再將50 μL菌懸液接種于11 mL CAMHT肉湯中,取100 μL肉湯懸液加至藥敏板中,CIP濃度梯度為0.032 μg/mL、0.064 μg/mL、0.128 μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL,NAL濃度梯度為1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL和32 μg/mL。藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M45文件,以CIP MIC<1 mg/mL時(shí)敏感,MIC=2 mg/mL時(shí)中介,MIC≥4 mg/mL時(shí)耐藥,NAL MIC>32 mg/mL時(shí)耐藥。根據(jù)氣單胞菌對(duì)NAL和CIP的耐藥情況,將111株菌分為耐NAL-CIP、CIP敏感NAL耐藥和NAL-CIP敏感3個(gè)類別。

1.4DNA提取及PCR反應(yīng) 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取氣單胞菌基因組DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260 nm、A280 nm和A310 nm,根據(jù)公式dsDNA=50×(A260 nm-A310 nm)×稀釋倍數(shù)(ng/μL)計(jì)算核酸濃度,以A260 nm/A280 nm>1.8,核酸濃度大于50 ng/μL為合格。核酸標(biāo)本置于-20 ℃保存。氣單胞菌的耐藥基因[gyrA,gyrB,parC,parE,qnrA,qnrB,qnrVC,QnrS,aac(6′)-Ib-cr,qepA]的擴(kuò)增引物序列和參考文獻(xiàn)見(jiàn)表1,其中g(shù)yrA,gyrB,parE,qepA基因的引物由NCBI primer designing tool軟件設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系:EmeraldAmp MAX PCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1),72 ℃延伸40 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)成像后,陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司經(jīng)ABI 3730XL測(cè)序儀對(duì)gyrA,gyrB,parC,parE,QnrS,aac(6′)-Ib-cr基因進(jìn)行Sanger法正、反測(cè)序,刪除測(cè)序產(chǎn)物前后各50個(gè)bp,使用Chromas1.0.0.1軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行拼接,使用CLC Sequence Viewer 6軟件對(duì)轉(zhuǎn)化成的氨基酸片段進(jìn)行比對(duì)。其中Gap open cost 設(shè)為10.0,gap extension cost設(shè)為1.0。

2 結(jié)果

2.1氣單胞菌菌株耐藥表型分析 111株菌中,CIP耐藥率為6.3%(7/111),敏感率為93.7%(104/111);NAL耐藥率為55.0%(61/111),敏感率為45.0%(50/111)。111株菌中,7株對(duì)NAL-CIP耐藥,54株對(duì)CIP敏感、對(duì)NAL耐藥,50株對(duì)CIP和NAL都敏感。

2.2QRDR突變位點(diǎn)與耐藥表型分析 部分基因的測(cè)序圖譜見(jiàn)圖1,基因突變結(jié)果見(jiàn)表2,部分氨基酸比對(duì)見(jiàn)圖2。50株NAL-CIP敏感株均未發(fā)生QRDR突變。54株NAL耐藥CIP敏感的菌株中,gyrA基因第83位絲氨酸(Ser)均發(fā)生突變,其中A.hydrophila(5株),A.aquariorum(11株)和A.sanarellii(1株)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile);A.caviae有95%(25/26)突變?yōu)镮le,1株突變?yōu)榫彼?Arg);15株A.veronii突變?yōu)镮le或纈氨酸(Val)。在耐NAL-CIP的7株氣單胞菌(包括4株A.hydrophila和3株A.caviae)中,除了gyrA基因第83位點(diǎn)突變?yōu)镮le外,parC基因第87位還由Ser突變?yōu)镮le。而在CIP敏感株中,只有0.058%(6/104)同時(shí)存在gyrA基因Ser83Ile/Val突變和parC基因Ser87Ile/Tyr突變。

圖2 gyrA氨基酸部分比對(duì)圖

表2 氣單胞菌QRDR突變位點(diǎn)和耐藥表型的對(duì)比分析

2.3PMQR的檢出情況 共檢出8株菌攜帶QnrS基因,其中4株菌耐藥表型為NAL-CIP。耐NAL-CIP中,QnrS陽(yáng)性菌株占4/7。7株菌攜帶aac(6′)-Ib-cr基因,其中6株菌耐藥表型為NAL-CIP。耐NAL-CIP中,aac(6′)-Ib-cr陽(yáng)性菌株占6/7。對(duì)CIP敏感NAL耐藥的54株菌中,菌株BJ065 檢出QnrS基因,菌株BJ088檢出aac(6′)-Ib-cr基因。2株菌的喹諾酮耐藥水平與同類別其他菌株相同,未見(jiàn)升高。對(duì)CIP-NAL敏感的50株菌中,3株檢出QnrS基因,3株菌喹諾酮耐藥性均較其他CIP-NAL敏感菌強(qiáng),且耐藥性提升了4～8倍。見(jiàn)表3。

表3 氣單胞菌PMQR檢出情況和菌株耐藥表型對(duì)比分析

3 討論

氣單胞菌喹諾酮耐藥在世界范圍內(nèi)廣泛存在,對(duì)現(xiàn)代感染醫(yī)學(xué)是個(gè)潛在的威脅,有必要對(duì)其加強(qiáng)監(jiān)測(cè)分析[16]。國(guó)內(nèi)外對(duì)不同環(huán)境中分離的氣單胞菌研究發(fā)現(xiàn),氣單胞菌產(chǎn)生喹諾酮耐藥的機(jī)制主要為喹諾酮作用靶位改變以及不同PMQR基因的流行,QRDR與PMQR對(duì)喹諾酮耐藥具有相加性或協(xié)同性[17-20]。

QRDR突變主要位于gyrA亞基和parC亞基末端,這些突變改變了喹諾酮藥物的結(jié)合部位,從而降低了喹諾酮藥物敏感性[21]。Shakir等[22]發(fā)現(xiàn)gyrA亞基上的Ser83Ile/Val和Leu92Met,且證實(shí)聯(lián)合parC亞基上Ser80Ile/Phe定點(diǎn)突變對(duì)氣單胞菌高水平耐藥起到關(guān)鍵作用。本研究中g(shù)yrA發(fā)生Ser83Ile/Arg/Val突變導(dǎo)致了菌株對(duì)NAL耐藥,與以往研究[22]不同,本次試驗(yàn)中所有菌株gyrA的第92位都是Met,提示gyrA的Ser83Ile/Arg/Val對(duì)NAL耐藥起到關(guān)鍵作用。耐NAL-CIP菌株最常見(jiàn)的突變殘基是gyrA/parC亞基上的Ser和Asp/Glu[23],而本次研究中,耐NAL-CIP菌株突變殘基均為gyrA/parC亞基上的Ser。對(duì)NAL和CIP敏感的50株菌中,3株菌檢出QnrS,其耐藥性提升了4～8倍,表明QnrS單獨(dú)作用可以輕微提高菌株的喹諾酮耐藥性。對(duì)NAL-CIP耐藥的7株菌中,6株菌檢出至少一種PMQR?；谝陨辖Y(jié)果,推測(cè)在氣單胞菌中,gyrA的第83位Ser突變可使菌株對(duì)NAL耐藥,對(duì)CIP敏感性下降,進(jìn)一步結(jié)合parC的第87位由Ser突變位為Ile,其累積突變聯(lián)合PMQR可誘導(dǎo)菌株對(duì)CIP產(chǎn)生耐藥。

QnrS和acc(6)-Ib-cr在世界各地均有分布,不同地區(qū)不同來(lái)源檢出率不盡相同。從我國(guó)數(shù)據(jù)看,QnrS在動(dòng)物源的菌株中檢出率高,從臨床標(biāo)本中檢出率略低,如在豬源沙門氏菌株中檢出率高達(dá)89.7%[24],在兔源的大腸埃希菌株中QnrS檢出高達(dá)50%以上[25],而在紹興市某醫(yī)院患者分離大腸埃希菌中檢出率為1.6%[26],北京腸道門診分離沙門菌中檢出率為23.7%[27]。本研究中氣單胞菌QnrS攜帶率為7.2%,acc(6)-Ib-cr攜帶率為6.3%,與其他研究基本一致。

本研究結(jié)果顯示PMQR單獨(dú)作用和gyrA亞基的Ser83突變可使氣單胞菌對(duì)喹諾酮低水平耐藥,氣單胞菌實(shí)現(xiàn)喹諾酮高水平耐藥主要依賴gyrA亞基的Ser83Ile/Arg/Val和parC亞基的Ser87Ile定點(diǎn)突變聯(lián)合PMQR共同作用。本次研究受樣本數(shù)量及種群分布的影響,研究結(jié)果有一定的局限性。后續(xù)研究筆者會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)充臨床樣本進(jìn)行深入研究,希望能得到關(guān)于氣單胞菌屬的重要種水平細(xì)菌的藥物敏感性和喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制更為詳實(shí)的數(shù)據(jù),為臨床診治氣單胞菌相關(guān)性腹瀉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。