江思婧，李靜，劉暢，牟雁東

1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000；2.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川成都 610072

放射性口腔黏膜炎是頭頸癌放射治療最常見的并發(fā)癥之一，90%接受頭頸癌放射治療的患者均會(huì)發(fā)生放射性口腔黏膜炎，其導(dǎo)致的疼痛會(huì)引起患者營(yíng)養(yǎng)攝入受限及說話困難，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前尚無有效的解決方法。因此，尋找預(yù)防放療患者發(fā)生放射性口腔黏膜炎的措施十分必要［1-2］。研究表明，活性氧清除劑，如氨磷汀和N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）可抑制放射性口腔黏膜炎的發(fā)生［3-4］，但化合物的副作用（如過敏性反應(yīng)等）和靜脈注射的給藥方式限制了其臨床應(yīng)用。

枸杞糖肽（Lycium barbanunglycopeptide，LbGP）是從枸杞子提取獲得糖肽與肽的復(fù)合物。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，LbGP 具有抗氧化活性，是一種天然的防輻射產(chǎn)品［5-8］。目前，尚無關(guān)于LbGP 用于放射保護(hù)的研究報(bào)道，本文以人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT 細(xì)胞）為研究對(duì)象，探討LbGP 對(duì)其的輻射保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為研發(fā)以LbGP 為基礎(chǔ)的輻射防護(hù)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HaCaT 細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 LbGP 呈紅褐色粉末，避光4 ℃保存，由寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司提供。

1.3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及0.25%胰酶均購自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒及總超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（WST-8 法）均購自北京蘭杰柯科技有限公司；總RNA 提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；HiScriptⅢRTSupperMix for qPCR 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；H2DCFH-DA 探針購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor2，Nrf2）單克隆抗體購自美國(guó)Abcam 公司；兔抗p-Nrf2 單克隆抗體購自美國(guó)Abcam 公司；鼠抗β-actin單克隆抗體、NADPH 氧化還原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）多克隆抗體、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的人抗兔IgG 及抗鼠IgG 均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞用含5%FBS、100 U/mL青-鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)液于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2 ～3 d換液1次，待細(xì)胞貼壁融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 LbGP細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將LbGP粉末用RPMI1640培養(yǎng)液溶解，配制成0、0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL 的LbGP 溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾。將HaCaT 細(xì)胞按3×103個(gè)/孔接種至96 孔板，于37 ℃培養(yǎng)16 h；分別加入不同濃度的LbGP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 放射對(duì)HaCaT 細(xì)胞活性影響的檢測(cè) 將HaCaT細(xì)胞按3 × 103個(gè)/孔接種至96 孔板，于37 ℃培養(yǎng)16 h；更換新鮮培養(yǎng)液，用直線加速器按6 Gy/min速率分別照射4、8、12、16、20、24、28 Gy，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不放射）；繼續(xù)培養(yǎng)3 d，用CCK-8 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以各劑量組與空白對(duì)照組檢測(cè)值的比值作為各組的細(xì)胞活性，選擇可將細(xì)胞活性下降一半的劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 LbGP對(duì)放射后HaCaT細(xì)胞活性影響的檢測(cè) 將HaCaT細(xì)胞按3×103個(gè)/孔接種至96 孔板，于37 ℃培養(yǎng)16 h；分別加入0、0.05、0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、3 mg/mL 的LbGP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不加LbGP 不放射）；換液，用1.6 項(xiàng)確定的劑量照射細(xì)胞，用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以各劑量組與空白對(duì)照組檢測(cè)值的比值作為各組的細(xì)胞活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 LbGP 對(duì)放射誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞損傷模型氧化應(yīng)激影響的檢測(cè) 將HaCaT 細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種至6 孔板，于37 ℃培養(yǎng)16 h。將HaCaT 細(xì)胞分為空白對(duì)照組（不加LbGP不放射）、放射組（1.6項(xiàng)確定的劑量照射1 h）、LbGP+放射組（1.7 項(xiàng)確定的濃度作用24 h 后，1.6 項(xiàng)確定的劑量照射1 h），放射后用H2DCFH-DA 探針孵育細(xì)胞30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 LbGP對(duì)放射誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型SOD活性影響的檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種至6 孔板中，同1.8 項(xiàng)進(jìn)行分組及處理，采用總SOD 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的SOD 活性。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 各組HaCaT細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。引物序列見表1，由北京擎科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。將HaCaT細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按1.8 項(xiàng)進(jìn)行分組及處理，其中放射時(shí)間為1、3、5 h，消化收集細(xì)胞，用RNA fast200 試劑盒提取總RNA，測(cè)定濃度純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃8 s，60 ℃15 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：60 ℃60 s，95 ℃15 s。以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算Nrf2、HO-1、NQO1基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.11 各組HaCaT細(xì)胞中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法。同1.10項(xiàng)進(jìn)行分組及處理，采用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；加入兔抗Nrf2 單克隆抗體、兔抗p-Nrf2 單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、NQO1多克隆抗體、HO-1單克隆抗體（均為1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3 次，每次10 min，分別加入HRP 標(biāo)記的人抗兔IgG及抗鼠IgG（均1∶10 000稀釋），室溫孵育1 h；用PBST洗滌3 次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像，ImagJ 1.53e 軟件分析灰度，以目的蛋白/β-actin表示各蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，數(shù)據(jù)檢測(cè)符合方差齊性，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LbGP的細(xì)胞毒性 0、0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL LbGP組HaCaT細(xì)胞A450分別為0.78±0.02、0.74 ± 0.03、0.81 ± 0.02、0.74 ± 0.01、0.8 ± 0.06、0.74±0.03、0.74±0.02、0.74±0.01，與0 mg/mL LbGP 組比較，各LbGP 濃度組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.52，P＞0.05）。表明LbGP無細(xì)胞毒性。

2.2 放射對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響 4、8、12、16、20、24、28 Gy 組的HaCaT 細(xì)胞活性分別約為85%、80%、45%、35%、25%、20%、18%。12 Gy 組HaCaT 細(xì)胞活性下降了約1/2，選擇12 Gy 照射劑量建立放射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 LbGP對(duì)放射后HaCaT細(xì)胞活力的影響 0、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.5、3 mg/mL LbGP 組的HaCaT 細(xì)胞活性分別約為58.6%、64.5%、66.9%、70.0%、70.8%、70.3%、68.8%、54.0%，0.1 ～1.5 mg/mL LbGP組的細(xì)胞活性大幅增加，其中0.8 mg/mL LbGP 保護(hù)作用最強(qiáng)，因此采用該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 LbGP對(duì)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型氧化應(yīng)激的影響空白對(duì)照組、放射組、LbGP+放射組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別為996.00±28.61、4005.33±17.91、1495.33±15.06。與空白對(duì)照組比較，放射組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著增加（F= 2.55，P＜0.001）；與放射組比較，LbGP+放射組HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低（F=3.61，P＜0.001）。見圖1。表明LbGP對(duì)放射導(dǎo)致的活性氧具有清除作用，從而維持細(xì)胞活性。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS含量Fig.1 Detection of ROS content in HaCaT cells of various groups by flow cytometry

2.5 LbGP對(duì)放射誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型SOD活性的影響空白對(duì)照組、放射組、LbGP+放射組HaCaT細(xì)胞內(nèi)SOD含量分別為（164.07±11.94）、（97.23±13.22）、（154.82±14.67）U/mg。與空白對(duì)照組比較，放射組細(xì)胞內(nèi)SOD活性顯著降低（F=1.23，P＜0.01）；與放射組比較，LbGP+放射組SOD活性明顯升高（F=1.23，P＜0.05）。表明LbGP可減輕放射誘導(dǎo)SOD活性的降低。

2.6 各組HaCaT細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 放射1 h 后，與空白對(duì)照組比較，放射組Nrf2及NQO1基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為4.00及9.00，P均＞0.05），HO-1基因明顯升高（F=9.00，P＜0.05）；與放射組比較，LbGP+放射組Nrf2、HO-1、NQO1基因的mRNA 水平明顯升高（F分別為1.00、21.78及36.00，P均＜0.05）；放射3 h后，LbGP+放射組的Nrf2、HO-1、NQO1基因的mRNA水平達(dá)峰值，放射5 h后，略下降，但與放射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.20 ～16.00，P均＜0.05），見表2。表明LbGP 可激活放射細(xì)胞內(nèi)的Nrf2基因，促進(jìn)其下游因子HO-1、NQO1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

表2 各組HaCaT細(xì)胞中HO-1、NQO1、Nrf2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（±s，n=3）Tab.2 Effect of LbGP on mRNA expression of HO-1，NQO1 and Nrf2 in HaCaT cells of various groups（±s，n=3）

表2 各組HaCaT細(xì)胞中HO-1、NQO1、Nrf2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（±s，n=3）Tab.2 Effect of LbGP on mRNA expression of HO-1，NQO1 and Nrf2 in HaCaT cells of various groups（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，a表示P ＜0.05；與放射組比較，b表示P ＜0.05，bb表示P ＜0.01，bbb表示P ＜0.001。

Nrf2基因HO-1基因NQO1基因組別空白對(duì)照組放射組LBP+放射組1 h 1.00±0.02 0.92±0.04 1.43±0.04bbb 3 h 1.02±0.12 1.18±0.16 1.53±0.04bb 5 h 1.02±0.20 1.18±0.16 1.53±0.04b 1 h 1.00±0.07 1.53±0.03a 13.33±0.14bbb 3 h 1.03±0.24 1.70±0.18a 13.33±0.22bbb 5 h 1.00±0.07 1.31±0.08 7.39±0.18bbb 1 h 1.00±0.03 0.94±0.01 1.44±0.06b 3 h 1.00±0.03 1.00±0.14 2.04±0.18bbb 5 h 1.01±0.15 1.06±0.20 1.95±0.34bbb

2.7 各組HaCaT 細(xì)胞中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)水平 與空白對(duì)照組比較，放射組的NQO1、Nrf2蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為1.78和1.00，P均＞0.05），HO-1蛋白含量明顯增加（F=1.37，P＜0.05），p-Nrf2 蛋白含量及p-Nrf2/Nrf2 值均顯著下降（F分別為2.75和1.14，P均＜0.01）。與放射組比較，LbGP+放射組的Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白含量及p-Nrf2/Nrf2值均顯著上升（F分別為4.00、2.25、6.25、1.27及1.00，P均＜0.05）。表3 和見圖2。表明LbGP可減少放射誘導(dǎo)損傷HaCaT 細(xì)胞中p-Nrf2 蛋白水平，上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，激活Nrf2 及其下游抗過氧化酶。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組HaCaT細(xì)胞中HO-1、NQO1、Nrf2、p-Nrf2蛋白的表達(dá)情況Fig.2 Western blotting of HO-1，NQO1，Nrf2 and p-Nrf2 proteins in HaCaT cells of various groups

表3 各組HaCaT細(xì)胞中HO-1、NQO1、Nrf2、p-Nrf2蛋白的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab.3 Expression levels of HO-1，NQO1，Nrf2 and p-Nrf2 proteins in HaCaT cells of various groups（±s，n=3）

表3 各組HaCaT細(xì)胞中HO-1、NQO1、Nrf2、p-Nrf2蛋白的表達(dá)水平（±s，n=3）Tab.3 Expression levels of HO-1，NQO1，Nrf2 and p-Nrf2 proteins in HaCaT cells of various groups（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，aa表示P ＜0.01，aaa表示P ＜0.001；與放射組比較，b表示P ＜0.05，bbb表示P ＜0.001。

組別空白對(duì)照組放射組LBP+放射組0.52±0.02 0.60±0.02 0.81±0.05b 0.80±0.06 0.82±0.08 1.00±0.09b 0.52±0.03 0.30±0.04aa 0.64±0.06bbb 0.75±0.02 0.79±0.02 0.92±0.04 0.69±0.06 0.37±0.06aaa 0.70±0.06bbb HO-1NQO1p-Nrf2Nrf2p-Nrf2/Nrf2

3 討論

輻射損傷機(jī)制主要有兩種：一是高能量直接解離如核酸、蛋白質(zhì)的生物分子，二是低能量輻射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分子的輻解，產(chǎn)生多種ROS和自由基，從而破壞細(xì)胞生物分子［9］。細(xì)胞內(nèi)一般有70%～80%的水分，放射劑量的輻射通過產(chǎn)生ROS 和自由基可造成相應(yīng)比例的損傷。本研究結(jié)果表明，放射可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 含量急劇增加至基礎(chǔ)含量的3 倍，與BLIJLEVENS 等［10］報(bào)道的放射性口腔黏膜炎細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高的結(jié)果相符?？惯^氧化物質(zhì)是預(yù)防和治療放射損傷的潛在藥物，基于LbGP 的抗氧化活性，本研究采用LbGP 預(yù)處理HaCaT 細(xì)胞后，再進(jìn)行放射，檢測(cè)結(jié)果顯示，LbGP 可清除放射細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS，增加放射后細(xì)胞的活性，且LbGP 可激活Nrf2，升高p-Nrf2 含量，促進(jìn)其下游抗氧化酶SOD、HO-1、NOQ1的產(chǎn)生。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是一種強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活因子，在誘導(dǎo)許多細(xì)胞保護(hù)基因表達(dá)以應(yīng)對(duì)氧化和親電應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用［11］。在無外界刺激的情況下，kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated proteinl，keapl）可抑制Nrf2的活性，并介導(dǎo)其在胞漿中的蛋白酶體降解；在氧化應(yīng)激的情況下，Nrf2被PKC 磷酸化［12］，p-Nrf2 與keap 分離，進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）序列結(jié)合，激活A(yù)RE 驅(qū)動(dòng)基因，這些基因編碼包括SOD、NQO-1、HO-1 等的解毒酶和抗氧化蛋白，構(gòu)成細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的第一線防御系統(tǒng)［13-14］。SOD、HO-1、NQO1 均是人體內(nèi)重要的保護(hù)酶［15-17］，可降低在外界刺激下細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生過多的ROS。PARK等［18］研究證明，半步蛋白A（Hemistepsin A）可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路保護(hù)HaCaT細(xì)胞免受過氧化應(yīng)激損傷。XIAO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，中藥白術(shù)中提取的倍半萜類單體白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（atractylenolideⅡ，ATRⅡ）可通過促進(jìn)抗氧化因子HO-1和NQO1的表達(dá)顯著抑制電離損傷。本研究結(jié)果顯示，LbGP 預(yù)處理增加了放射細(xì)胞內(nèi)的Nrf2、p-Nrf2含量及p-Nrf2/Nrf2比值，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)SOD-1 活性，提高了放射細(xì)胞內(nèi)HO-1、NOQ1基因mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平，表明LbGP可通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)Nrf2，并激活其下游抗氧化基因，以減輕放射導(dǎo)致的HaCAT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，LbGP 可有效保護(hù)放射細(xì)胞的活性，降低放射誘導(dǎo)的ROS，增強(qiáng)SOD活性和抗氧化酶HO-1、NQO1的產(chǎn)生。其作用機(jī)制與LbGP激活重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2有關(guān)，為進(jìn)一步深入研究LbGP藥理作用及提高中藥材提取物在放射治療中保護(hù)正常組織的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。