王嘉鑫， 劉佳， 秦金梅， NYV Mondele Mbola， 孟子暉， 薛敏

基于兩親性超分子的共價(jià)水凝膠輔助蛋白折疊

王嘉鑫， 劉佳， 秦金梅， NYV Mondele Mbola， 孟子暉， 薛敏

（北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 北京 100190）

采用2-氨基-4-羥基-6甲基嘧啶(MIS)和1,6-己二異氰酸酯(HDI)合成了中間體2-(6-異氰酸酯己基脲)- 6-甲基-4[1]嘧啶酮(UPy-C6-NCO), 并引入4-羥基丁基丙烯酸酯(HBA), 合成了一種新型單體2-{6-[3-(6-甲基-4-氧代-1,4-二氫嘧啶-2-基)脲基]己烷氨甲酰氧基}丙烯酸丁酯(UPy-C6-HBA). 通過(guò)紫外光引發(fā)自由基聚合， 使UPy-C6-HBA和丙烯酰胺(AM)、,-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)進(jìn)行共聚, 制備了具有均勻多孔結(jié)構(gòu)和高度溶脹性的物理化學(xué)雙交聯(lián)水凝膠. 將溶菌酶包埋在含UPy-C6-HBA單體的水凝膠基質(zhì)中, 通過(guò)疏水作用輔助溶菌酶進(jìn)行體外折疊復(fù)性研究. 結(jié)果表明, UPy-C6-HBA含量、 凝膠用量、 溶菌酶濃度和復(fù)性溫度對(duì)復(fù)性效果均有影響. 當(dāng)環(huán)境溫度為25 ℃時(shí), 含UPy-C6-HBA單體15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水凝膠可以使0.25 mg/mL溶菌酶的復(fù)性率提高41%. 研究結(jié)果表明, 向凝膠體系中加入U(xiǎn)Py-C6-HBA單體顯著提高了溶菌酶的復(fù)性率, 對(duì)于高濃度變性溶菌酶的復(fù)性具有重要意義.

2-{6-[3-(6-甲基-4-氧代-1,4-二氫嘧啶-2-基)脲基]己烷氨甲酰氧基}丙烯酸丁酯; 超分子水凝膠; 蛋白質(zhì)折疊; 溶菌酶

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是由多肽長(zhǎng)鏈通過(guò)分子內(nèi)氫鍵和疏水作用主導(dǎo)， 在水中由線性自發(fā)折疊而成， 蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型往往決定了其性質(zhì)和功能［1，2］. 通過(guò)高濃度變性劑使蛋白質(zhì)保持溶劑化防止其折疊， 當(dāng)變性條件不劇烈時(shí)， 在適當(dāng)條件下可以使變性的蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性， 這一過(guò)程被稱為蛋白質(zhì)折疊或蛋白質(zhì)復(fù)性［3］. 目前蛋白質(zhì)的復(fù)性方法有透析復(fù)性、 化學(xué)試劑復(fù)性、 天然分子伴侶以及人工分子伴侶輔助復(fù)性等［4，5］. 由于大部分天然分子伴侶對(duì)折疊態(tài)蛋白具有特異性， 且輔助機(jī)制復(fù)雜， 因此生物友好、 結(jié)構(gòu)可控的人工分子伴侶應(yīng)運(yùn)而生. 人工分子伴侶主要是通過(guò)模擬天然分子伴侶， 抑制蛋白質(zhì)折疊中間體之間的不可逆聚集來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊. 有機(jī)硅介孔材料具有良好的生物相容性以及尺寸、 性質(zhì)可控的孔道結(jié)構(gòu)， 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥的研究［6］. Lu等［7］利用有機(jī)硅介孔材料獨(dú)特的孔隙結(jié)構(gòu)將溶菌酶封裝到介孔通道內(nèi)減少蛋白聚集， 通過(guò)聚乙烯醇誘導(dǎo)溶菌酶釋放實(shí)現(xiàn)溶菌酶的折疊與復(fù)性. 然而這種有機(jī)硅材料制備流程復(fù)雜， 其孔道以及尺寸輔助折疊的機(jī)理并不明確， 多用于小分子蛋白質(zhì). 此外， 通過(guò)硅表面硅醇基團(tuán)與溶菌酶氨基酸殘基的靜電相互作用捕獲蛋白對(duì)環(huán)境的pH值和蛋白的種類有一定限制. 兩親性分子對(duì)和自組裝納米凝膠通過(guò)捕捉變性蛋白暴露出的疏水位點(diǎn)可以防止蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集， 可用于輔助蛋白質(zhì)折疊［8］. Hoshino等［9］以-異丙基丙烯酰胺（NIPAm）為骨架， 制備了一種表面易于官能化、 制備過(guò)程簡(jiǎn)便的納米水凝膠顆粒， 其與變性溶菌酶具有強(qiáng)親和力， 從而對(duì)其包封， 輔助其正確折疊， 釋放低親和力的天然溶菌酶， 實(shí)現(xiàn)了溶菌酶折疊的簡(jiǎn)單有效控釋. 生物友好的兩親性超分子聚合物具有表面易于官能化、 結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)的特點(diǎn)， 能在溶劑中自組裝構(gòu)建膠束， 使其輔助蛋白質(zhì)折疊成為可能［10］. Kameta等［11］通過(guò)兩親性超分子自組裝納米管水凝膠成功包封變性天然熒光綠色蛋白（GFP）， 輔助其折疊. 該工作證明了超分子水凝膠因子作為有效的共佐劑在促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面的潛力.

脲基嘧啶酮（UPy）是一種具有多個(gè)質(zhì)子供體和受體的多功能超分子單元. 獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得UPy可以通過(guò)氫鍵作用與不同功能化分子組裝成強(qiáng)可調(diào)控性和多功能性水凝膠［12，13］. UPy水凝膠具有易于官能團(tuán)化、 高穩(wěn)定性、 孔徑可控制及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)， 可以作為載體將藥物等生物活性物質(zhì)包封在水凝膠孔隙中， 并通過(guò)控制孔徑及調(diào)節(jié)水凝膠結(jié)構(gòu)等手段實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的可控釋放［14～16］. Muthuvijayan等［16］報(bào)道了一種氧化藻酸鹽和明膠-脲基嘧啶酮（G-UPy）制備的自修復(fù)水凝膠用于軟組織再生支架， 該水凝膠中具有UPy四重氫鍵陣列， 能夠在界面處無(wú)縫自愈合. 基于UPy及其衍生物的超分子聚合物可以在不同的溶劑中通過(guò)氫鍵及疏水相互作用等非共價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)自組裝， 形成不同空間結(jié)構(gòu)的材料， 已經(jīng)被應(yīng)用于藥物傳遞、 組織修復(fù)和細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域的研究［17，18］.

溶菌酶能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁， 因此被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域的抗菌藥物研發(fā)中. 但溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)一直受到折疊不完整和純化困難等問(wèn)題的制約. 本文旨在探究UPy超分子水凝膠對(duì)溶菌酶蛋白質(zhì)折疊的輔助作用， 并優(yōu)化輔助折疊的條件， 以提高其工業(yè)化生產(chǎn)效率和純度. 本文使用不同濃度的UPy超分子水凝膠輔助溶菌酶蛋白質(zhì)的折疊， 并研究其對(duì)蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定化的影響. 基于UPy功能化單體制備的物理化學(xué)雙交聯(lián)水凝膠網(wǎng)絡(luò)中含有丙烯酰胺（AM）主鏈、 四重氫鍵偶聯(lián)UPy單元及疏水碳鏈， 與變性蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合力， 可以抑制其聚集， 因此適合用于協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

丙烯酰胺（AM， A.R.級(jí)），，-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis， A.R.級(jí)）、 三羥甲基氨基甲烷（Tris， A.R.級(jí)）、 二硫蘇糖醇（DTT）、 溶菌酶（20000 U/mg）、 磷酸（A.R.級(jí)， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%）、 二月桂酸二丁基錫（DBTDL， 97.5%）、 2-氨基-4-羥基-6甲基嘧啶（MIS， A.R.級(jí)）、 1，6-己二異氰酸酯（HDI， A.R.級(jí)）和丙烯酸羥丁酯［HBA， A.R.級(jí)， 油水分配系數(shù)（lg）為0.68］， 北京百靈威科技有限公司； 2-羥基-4'-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（Irgacure 2959， 純度≥98%）， 阿拉丁試劑（上海）有限公司； 二甲基亞砜（DMSO， A.R.級(jí)）、 十二水合磷酸氫二鈉及考馬斯亮藍(lán)G-250， 江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司； 尿素（A.R.級(jí)）和濃鹽酸， 北京市通廣精細(xì)化工公司； 乙二胺四乙酸（EDTA， A.R.級(jí)）、 谷胱甘肽還原型（GSH）、 谷胱甘肽氧化型（GSSG）以及溶壁微球菌， 生工生物工程（上海）股份有限公司.

CL-1000L型紫外交聯(lián)儀， 美國(guó)UVP公司； AutoPore Ⅳ 9500型高性能全自動(dòng)壓汞儀， 麥克默瑞提克（上海）儀器有限公司； UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis）， 島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司； J-1500型圓二色譜儀（CD）， 佳斯科儀器（北京）有限公司； Zeiss Supra55型掃描電子顯微鏡（SEM）， 蔡司（德國(guó)）集團(tuán)； JASCO J-1500型圓二色譜儀， 日本分光株式會(huì)社； Thermo IS5型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）， 美國(guó)賽默飛世爾科技公司； Bruker Ascend 700M型核磁共振波譜儀（NMR）， 美國(guó)布魯克公司.

1.2　2-{6-[3-(6-甲基-4-氧代-1,4-二氫嘧啶-2-基)脲基]己烷氨甲酰氧基}丙烯酸丁酯(UPy-C6-HBA)單體的合成

將2.77 g MIS和2.5 g HDI加入100 mL三口圓底燒瓶中， 在氮?dú)夥諊掠?00 ℃攪拌24 h. 冷卻至室溫后， 加入50 mL正戊烷， 沉淀， 抽濾， 用過(guò)量正戊烷洗滌濾餅. 在50 ℃真空干燥箱中干燥16 h， 得到中間體2-（6-異氰酸酯己基脲）-6-甲基-4［1］嘧啶酮（UPy-C6-NCO）白色粉末， 產(chǎn)率為97%.

將2.3 g HBA和2.5 g UPy-C6-NCO加入500 mL三口燒瓶中. 加入200 mL干燥過(guò)的三氯甲烷， 以 約0.1 mL DBTDL為催化劑， 在氮?dú)夥諊掠?0 ℃攪拌反應(yīng)24 h. 過(guò)濾除去殘余固體后， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液至約50 mL. 將濾液滴入過(guò)量丙酮中， 靜置沉淀， 抽濾. 用過(guò)量丙酮洗滌， 于50 ℃真空干燥16 h， 得到UPy-C6-HBA白色粉末， 產(chǎn)率為89%.

1.3　超分子水凝膠的制備

將一定量AM和UPy-C6-HBA溶于DMSO中， 加入光引發(fā)劑Irgacure 2959和交聯(lián)劑Bis后通氮?dú)獬?0 min， 以400 r/min的速度常溫?cái)嚢?0 min. 將混合均勻的溶液轉(zhuǎn)移至模具中， 用365 nm 紫外光照射1 h， 引發(fā)單體共聚形成凝膠網(wǎng)絡(luò). UPy-C6-HBA占總單體（UPy-C6-HBA+AM+Bis）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0， 5%， 10%， 15%和20%. 將凝膠取出， 于純水中進(jìn)行溶劑置換5 d， 于-30 ℃冷凍干燥12 h， 凝膠分別命名為UCHG， 5%UCHG， 10%UCHG， 15%UCHG， 20%UCHG.

1.4　溶菌酶的變性和復(fù)性

配制含0.1 mol/L Tris、 8 mol/L尿素和30 mmol/L DTT， 且pH=8.5的還原變性緩沖液. 將一定量的天然溶菌酶溶于變性緩沖液中， 在37 ℃、 100 r/min搖床中孵育4 h， 制備還原變性溶菌酶. 配制含有0.1 mol/L Tris、 1 mmol/L EDTA、 10 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSH的復(fù)性緩沖液， 用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為8.5. 將變性溶菌酶緩慢加入復(fù)性緩沖液中， 并加入一定量干燥的水凝膠， 置于一定溫度、 轉(zhuǎn)速為 100 r/min的搖床中復(fù)性.

1.5　超分子水凝膠輔助溶菌酶復(fù)性

固定復(fù)性溫度為25 ℃、 變性溶菌酶濃度為0.25 mg/mL、 加入水凝膠與溶菌酶的質(zhì)量比為20∶1.

使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定溶菌酶的含量. 將100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶解于50 mL 95%的乙醇中， 加入100 mL 85%的磷酸， 用去離子水定容至1 L. 用濾紙過(guò)濾試劑中沉淀的染料后儲(chǔ)存于棕色瓶中. 配制100 μg/mL的天然溶菌酶溶液， 稀釋成體積為1 mL的不同濃度（10， 20， 30， 40， 50和60 μg/mL）的蛋白溶液， 分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑， 充分混合后于20 min內(nèi)在595 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度， 平行測(cè)試3次， 結(jié)果取平均值， 得到溶菌酶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線. 使用比濁法測(cè)定溶菌酶的活性. 將20 mg溶壁微球菌溶解于50 mL 0.1 mol/L、 pH值為6.2的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中， 于25 ℃水浴加熱30 min， 得到底物溶液. 以PBS為參比溶液， 稀釋底物溶液至吸光度為0.6～0.7. 取3 mL底物溶液， 用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)試450 nm處的吸光度， 記為0. 加入20 μL酶溶液， 充分混合1 min后測(cè)試吸光度， 記為. 平行測(cè)試3次， 結(jié)果取平均值. 根據(jù)下式計(jì)算溶菌酶比活力（， U/mg）：

式中，（μg）為所加入酶液中酶的質(zhì)量.

以復(fù)性后溶菌酶比活力與天然溶菌酶比活力的比值， 即復(fù)性率（AR， %）來(lái)表征復(fù)性效果， 按下式計(jì)算復(fù)性率：

式中，0（U/mg）和（U/mg）分別為天然溶菌酶及復(fù)性后溶菌酶的比活力.

2 結(jié)果與討論

2.1　Upy衍生物的合成與表征

Scheme 1為單體的合成步驟示意圖. MIS與HDI在100 ℃下進(jìn)行親核加成得到中間體UPy-C6-NCO. 在催化劑的作用下， HBA上的羥基進(jìn)攻—NCO上的C原子， 得到UPy-C6-HBA.

Scheme 1Synthesis route of UPy?C6?HBA

圖1（A）為UPy-C6-NCO的核磁共振氫譜， 其中7.26處為氘代氯仿溶劑峰；13.10， 11.85和10.16處為UPy基團(tuán)的特征峰. 圖1（B）為UPy-C6-HBA的核磁共振氫譜， 其中13.06， 11.79和10.06處為UPy基團(tuán)的特征峰. 在氘代氯仿溶劑中， UPy結(jié)構(gòu)主要以二聚體的形式存在. 當(dāng)分子形成氫鍵時(shí)， 氫鍵中質(zhì)子周圍的電子云密度降低， 使質(zhì)子的信號(hào)明顯地移向低場(chǎng)， 化學(xué)位移變大， 因此UPy-C6-HBA的核磁共振氫譜顯示出低場(chǎng)的特征峰.

Fig.1　1H NMR spectra of UPy?C6?NCO(A) and UPy?C6?HBA(B)

圖2為UPy-C6-NCO和UPy-C6-HBA的紅外光譜圖. 譜線中， 2283 cm-1處為UPy-C6-NCO中—NCO的特征峰； 在譜線中沒(méi)有該吸收峰， 說(shuō)明UPy-C6-NCO完全反應(yīng)； 譜線在3319 cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰， 為—NHCOO—中N—H的伸縮振動(dòng)， 說(shuō)明成功合成了UPy-C6-HBA.

Fig.2　FTIR spectra of UPy?C6?NCO(a) and UPy?C6?HBA(b)

2.2　Upy-C6-HBA雙交聯(lián)水凝膠的表征

AM因其良好的溶解性以及可調(diào)控性， 已經(jīng)被廣泛用于多種水凝膠的制備［19］. AM與UPy-C6-HBA中的官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)， 形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu). UPy是一種合成路線簡(jiǎn)單、 可提供自互補(bǔ)四重氫鍵實(shí)現(xiàn)聚合的結(jié)構(gòu)單元. UPy與HDI通過(guò)親核加成反應(yīng)， 得到具有C6長(zhǎng)鏈的UPy-C6-NCO， 引入具有碳碳雙鍵以及羥基的4-HBA既可以提供化學(xué)交聯(lián)的位點(diǎn)， 又增加了UPy衍生物的親水性， 有利于增強(qiáng)水凝膠的溶脹性能. 由Scheme 2可見(jiàn)， 以Bis為化學(xué)交聯(lián)劑， AM和UPy-C6-HBA為單體， 通過(guò)光引發(fā)聚合制備了一種雙交聯(lián)水凝膠. 在該結(jié)構(gòu)中， UPy-C6-HBA之間通過(guò)形成四重氫鍵實(shí)現(xiàn)了物理交聯(lián).

Scheme 2Synthesis of UPy?C6?HBA hydrogel

由圖3可看出， 本文制備的5%UCHG和10%UCHG水凝膠均具有大量松散、 均一的微米級(jí)孔徑.

Fig.3　SEM images of 5%UCHG(A) and 10%UCHG(B)

圖4給出不同UPy-C6-HBA含量的水凝膠的總孔體積和總孔表面積（A）以及平均孔徑和孔隙率（B）. UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的水凝膠孔徑約為6.9 μm， 當(dāng)UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到10%時(shí)， 水凝膠孔徑下降到約4.9 μm. 這是因?yàn)閁Py-C6-HBA提供了分子間四重氫鍵作用（Scheme 2內(nèi)插圖）， 作為凝膠網(wǎng)絡(luò)的物理交聯(lián)點(diǎn)， 隨著UPy-C6-HBA含量增加， 水凝膠形成交聯(lián)更加緊密的結(jié)構(gòu)， 從而導(dǎo)致更小的凝膠孔隙與總孔體積以及更大的總孔表面積.

Fig.4　Cumulative pore volume, total pore area(A) and pore diameter, porosity(B) of UPy?C6?HBA hydrogel containing 5%, 10%, 15% and 20% UPy?C6?HBA

2.3　Upy-C6-HBA水凝膠輔助溶菌酶復(fù)性

溶菌酶變性后三維結(jié)構(gòu)被破壞， 暴露出大量疏水殘基， 經(jīng)過(guò)一系列的中間態(tài)， 緩慢折疊為天然態(tài)結(jié)構(gòu). 復(fù)性過(guò)程主要涉及蛋白分子內(nèi)相互作用. 同時(shí)溶菌酶折疊中間體顯示出很強(qiáng)的聚集傾向， 這一過(guò)程主要涉及分子間疏水作用. 溶菌酶的聚集與正確折疊互相競(jìng)爭(zhēng)， 阻礙了溶菌酶的復(fù)性， 因此有效地抑制溶菌酶分子間的疏水相互作用是促進(jìn)溶菌酶正確折疊、 提高復(fù)性率的關(guān)鍵. UPy經(jīng)過(guò)烷基修飾引入凝膠結(jié)構(gòu)中后， UPy具有氨基， 親水性強(qiáng)， 可形成四重氫鍵， 而烷基鏈具有疏水性， 兩者在凝膠結(jié)構(gòu)中形成雙親微環(huán)境. 在復(fù)性過(guò)程中加入冷凍干燥的水凝膠， 變性溶菌酶隨著水凝膠的溶脹進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部. 由于凝膠網(wǎng)絡(luò)中的疏水鏈段與變性溶菌酶的疏水作用比變性溶菌酶之間的疏水作用更強(qiáng)， 變性溶菌酶優(yōu)先與凝膠網(wǎng)絡(luò)中的疏水鏈段結(jié)合， 抑制了溶菌酶分子間的聚集. 同時(shí)， 變性溶菌酶的親水部分可在UPy附近得到穩(wěn)定， 超分子UPy有效地阻止了被吸附變性溶菌酶之間的相互作用， 為變性溶菌酶實(shí)現(xiàn)重新折疊提供了微環(huán)境. Hoshino等［9］證明以具有合適疏水作用的凝膠材料輔助變性溶菌酶復(fù)性， 有利于降低其復(fù)性的能壘， 使蛋白重新恢復(fù)到具有較低能量的自然狀態(tài). 與疏水鏈段結(jié)合的變性溶菌酶在分子內(nèi)相互作用下折疊為天然態(tài)溶菌酶， 其疏水殘基位于分子內(nèi)部， 與水凝膠的疏水作用減弱， 因此可以自動(dòng)脫離. 同時(shí)， 一部分變性溶菌酶進(jìn)入凝膠網(wǎng)絡(luò)使得復(fù)性緩沖液中的變性溶菌酶濃度降低， 有利于提高溶菌酶的復(fù)性率. 由Scheme 3可見(jiàn)， 超分子水凝膠吸水溶脹后， 內(nèi)部凝膠網(wǎng)絡(luò)通過(guò)疏水相互作用捕獲變性溶菌酶， 防止其聚集. 溶菌酶復(fù)性時(shí)疏水鏈向內(nèi)折疊， 蛋白與水凝膠網(wǎng)絡(luò)的相互作用減弱而被釋放到溶液中.

Scheme 3Proteins refolding by UPy?C6?HBA hydrogel

圖5是水凝膠在25 ℃下的溶脹曲線， 反映了水凝膠在微觀層面的高分子鏈段變化. 由圖5可見(jiàn)， 水凝膠的溶脹過(guò)程整體較為緩慢. 開始時(shí)由于水凝膠內(nèi)外滲透壓的差異， 水分子快速向水凝膠網(wǎng)絡(luò)滲透， 水凝膠快速溶脹， 4 min時(shí)達(dá)到了平衡溶脹倍率的一半. 之后溶脹速率放緩， 55 min后達(dá)到溶脹平衡. 這是因?yàn)楦叻肿渔湺蔚纳煺挂鹉z的彈性變形， 伸展到一定程度時(shí)會(huì)產(chǎn)生彈性收縮力使水凝膠網(wǎng)絡(luò)收縮， 當(dāng)溶劑分子的滲透引起的伸展和彈性變形引起的收縮這兩種趨勢(shì)抵消時(shí)， 水凝膠就達(dá)到了溶脹平衡狀態(tài). 在相同條件下， 水凝膠中UPy-C6-HBA含量越高， 水凝膠的溶脹倍率越低， 相應(yīng)的平衡含水量也越低. 與不含UPy-C6-HBA的對(duì)照樣品相比， 當(dāng)UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到20%時(shí)， 水凝膠的溶脹倍率由20.2倍降低為8.4倍， 平衡含水量也隨之降低. 這是因?yàn)閁Py-C6-HBA分子間通過(guò)氫鍵作用形成二聚體提供物理交聯(lián)， 同時(shí)分子上的疏水鏈段間產(chǎn)生疏水作用， 使水凝膠形成交聯(lián)更加致密的網(wǎng)絡(luò)， 阻礙水分子向凝膠內(nèi)部的擴(kuò)散.

Fig.5　Swelling curves of different hydrogels with different mass fraction of UPy?C6?HBA

對(duì)溶菌酶進(jìn)行圓二色譜分析， 實(shí)驗(yàn)掃描速度為200 nm/min， 掃描步長(zhǎng)為0.5 nm. 在圖6中， 200～250 nm為遠(yuǎn)紫外區(qū)， 信號(hào)峰主要是由C—N鍵的→躍遷和C=O鍵的→躍遷引起的， 可用于表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵的排布信息. 208和222 nm處的負(fù)峰為-螺旋的特征峰， 216 nm處 的負(fù)峰為-折疊的特征峰. 可見(jiàn)， 稀釋復(fù)性和Upy-C6-HBA水凝膠協(xié)助復(fù)性后的溶菌酶螺旋的含量降低，折疊的含量升高. 但與稀釋復(fù)性相比， 加水凝膠協(xié)助復(fù)性后的溶菌酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)更接近天然態(tài)溶菌酶.

Fig.6　CD spectra of lysozymes

2.4　UPy-C6-HBA含量和水凝膠加入量對(duì)復(fù)性效果的影響

UPy-C6-HBA含量對(duì)水凝膠的孔隙大小有顯著影響， 探究了不同UPy-C6-HBA含量水凝膠對(duì)于溶菌酶復(fù)性的影響. 固定復(fù)性溫度25 ℃、 變性溶菌酶濃度為0.25 mg/mL、 加入水凝膠與溶菌酶質(zhì)量比為 20∶1的條件不變， 制備了UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0， 5%， 10%， 15%和20%的水凝膠， 探究了水凝膠中UPy-C6-HBA含量對(duì)復(fù)性效果的影響.

由圖7（A）可見(jiàn)， 溶菌酶的復(fù)性率隨水凝膠中UPy-C6-HBA含量的增加先升高后降低， 在UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)復(fù)性率最大. 疏水作用［20］是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力， 溶菌酶折疊中間體的疏水殘基通過(guò)疏水作用與UPy-C6-HBA的疏水碳鏈結(jié)合， 從而阻止變性的溶菌酶分子之間相互作用形成聚集體， 促進(jìn)折疊向正確方向進(jìn)行. 但當(dāng)水凝膠的疏水性太強(qiáng)時(shí)， 不利于溶菌酶折疊中間體進(jìn)一步折疊為天然態(tài)［21］； 當(dāng)UPy-C6-HBA的添加量為20%時(shí)， 凝膠孔徑約為0.3 μm［圖4（B）］， 而變性溶菌酶聚集體的水力學(xué)直徑大于1 μm［9］， 此時(shí)變性溶菌酶聚集體并不能通過(guò)孔隙進(jìn)入凝膠內(nèi)部與其進(jìn)行充分的相互作用， 兩者作用只發(fā)生在凝膠表面， 故復(fù)性率有所下降. 當(dāng)水凝膠中不含UPy-C6-HBA時(shí)， 溶菌酶的復(fù)性率接近相同條件下稀釋復(fù)性方法的復(fù)性率， 說(shuō)明在加水凝膠協(xié)助復(fù)性過(guò)程中凝膠網(wǎng)絡(luò)中的疏水性UPy-C6-HBA起主要作用.

Fig.7　Effects of UPy?C6?HBA content on lysozyme renaturation(A) and effect of addition amount of 15%UPy?C6?HBA hydrogel on lysozyme renaturation(B)

由圖7（B）可知， 隨著水凝膠加入量的增加， 溶菌酶的復(fù)性率逐漸增加， 當(dāng)水凝膠加入量達(dá)到溶菌酶的20倍時(shí)復(fù)性率最大， 之后繼續(xù)增加水凝膠的量， 溶菌酶的復(fù)性率趨于平穩(wěn). 這是因?yàn)樗z網(wǎng)絡(luò)中的疏水鏈段聚集形成疏水區(qū)域， 通過(guò)與暴露在外的疏水殘基的疏水作用捕獲溶菌酶折疊中間體， 從而抑制溶菌酶分子間通過(guò)疏水作用而聚集， 促進(jìn)溶菌酶的正確折疊. 凝膠加入量較少時(shí)， 可提供的疏水位點(diǎn)也較少， 隨著水凝膠加入量的增加， 疏水位點(diǎn)增加， 溶菌酶的復(fù)性率也隨之增加. 當(dāng)水凝膠加入量達(dá)到一定值時(shí)， 水凝膠已經(jīng)提供了足夠的疏水位點(diǎn)與變性溶菌酶結(jié)合， 繼續(xù)增大水凝膠加入量不會(huì)對(duì)復(fù)性產(chǎn)生太大影響.

2.5　溶菌酶復(fù)性條件優(yōu)化

固定變性溶菌酶的初始濃度為10 mg/mL， 分別用復(fù)性緩沖液稀釋10， 12.5， 20和40倍得到終濃度為1.00， 0.80， 0.50和0.25 mg/mL的溶菌酶溶液， 在25 ℃、 加入水凝膠（UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%）與溶菌酶質(zhì)量比為20∶1的條件下探究溶菌酶濃度對(duì)復(fù)性效果的影響， 以純稀釋復(fù)性作為對(duì)照組， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示.

Fig.8　Influence of lysozyme concentration on the renaturation effect

Different lowercase letters mean significant diffe-rences among different concentration of lysozyme in the same treatment（<0.01）， asterisks indicate significant differences between different treatment methods at the same concentration（<0.01）.

由圖8可見(jiàn)， 隨著溶菌酶濃度的增加， 其復(fù)性率降低. 這是因?yàn)槿芫笣舛仍礁撸?分子間發(fā)生碰撞的幾率也越高， 溶菌酶折疊中間體之間的聚集反應(yīng)加快， 不利于蛋白質(zhì)的正確折疊. 與稀釋復(fù)性相比， 溶菌酶的濃度越高， 加入水凝膠對(duì)復(fù)性效果的提升越大. 加水凝膠協(xié)助復(fù)性方法對(duì)高濃度變性蛋白的復(fù)性有重要意義. 同時(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異統(tǒng)計(jì)分析， 在相同輔助折疊的條件下， 不同溶菌酶濃度的復(fù)性率結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（<0.01）； 不同輔助折疊方法對(duì)應(yīng)的復(fù)性率結(jié)果也存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（<0.01）， 說(shuō)明采用凝膠輔助蛋白復(fù)性的方法會(huì)對(duì)復(fù)性率結(jié)果產(chǎn)生顯著的提升.

固定溶菌酶濃度為0.25 mg/mL、 加入水凝膠（UPy-C6-HBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%）與溶菌酶質(zhì)量比為20∶1的條件不變， 分別在不同溫度下進(jìn)行溶菌酶復(fù)性實(shí)驗(yàn)， 探究復(fù)性溫度對(duì)復(fù)性效果的影響.

Fig.9　Effect of temperature on lysozyme renaturation

由圖9可見(jiàn)， 溶菌酶的復(fù)性率隨復(fù)性溫度的升高先升高后降低， 在25 ℃時(shí)復(fù)性效果最佳. 蛋白質(zhì)的正確折疊與聚集是兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)， 當(dāng)溫度升高時(shí)， 兩個(gè)反應(yīng)都會(huì)加速. 由于蛋白質(zhì)的正確折疊遵從一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)， 而蛋白質(zhì)的聚集過(guò)程遵從二級(jí)或更高級(jí)宏觀反應(yīng)動(dòng)力學(xué)， 因此聚集反應(yīng)速率增加得更快， 從這一角度來(lái)說(shuō)低溫更利于蛋白質(zhì)的復(fù)性. 但當(dāng)溫度較低時(shí)， 溶菌酶分子的擴(kuò)散速度減慢， 不利于其與水凝膠的結(jié)合和解離， 反而導(dǎo)致復(fù)性率的降低.

3 結(jié) 論

首先合成了一種具有Upy四重氫鍵結(jié)構(gòu)單元、 疏水碳鏈和雙鍵端基的新型單體UPy-C6-HBA. 將該單體以不同比例加入聚丙烯酰胺（PAM）水凝膠配方中， 制備了具有均勻多孔結(jié)構(gòu)、 高度溶脹的物理化學(xué)雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)水凝膠， 用以輔助溶菌酶進(jìn)行體外折疊復(fù)性. 使用UPy-C6-HBA的水凝膠通過(guò)疏水作用將溶菌酶包埋在凝膠基質(zhì)中， 重新折疊的溶菌酶具有天然構(gòu)象和酶活性. 考察了UPy-C6-HBA含量、 凝膠用量、 溶菌酶濃度、 復(fù)性溫度對(duì)復(fù)性效果的影響， 得到最佳復(fù)性條件. UPy-C6-HBA水凝膠使溶菌酶的復(fù)性率得到了較大提升， 特別是對(duì)于高濃度變性溶菌酶的復(fù)性有重要意義.

［1］ Bolen D. W.， Rose G. D.，， 2008，（1）， 339—362

［2］ Su L. L.， Shao X. G.， Cai W. S.，， 2023，（4）， 20220745（粟李醴， 邵學(xué)廣， 蔡文生. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2023，（4）， 20220745）

［3］ Curtis R.， Austerberry J.， Holloway L.，， 2019，， 860—878

［4］ Yamaguchi H.， Miyazaki M.，， 2014，（1）， 235—251

［5］ Wang Y.， Oosterwijk N. V.， Ali A. M.， Adawy A.， Anindya A. L.， D?mling A. S. S.， Groves M. R.，， 2017，（1）， 9345—9355

［6］ Wang X.， Lu D.， Austin R.， Agarwal A.， Mueller L. J.， Liu Z.， Wu J.， Feng P.，， 2007，， 5735—5739

［7］ Lu J.， Liong M.， Li Z.， Zink J. I.， Tamanoi F.，， 2010，（16）， 1794—1805

［8］ Singh N.， Nisha V.，， 2013，， 271—276

［9］ Nakamoto M.， Nonaka T.， Shea K. J.， Miura Y.， Hoshino Y.，， 2016，（13）， 4282—4285

［10］ Tandon S.， Horowitz P. M.，， 1987，（10）， 4486—4491

［11］ Kameta N.， Masuda M.， Shimizu T.，， 2012，（6）， 5249—5258

［12］ Skopinska W.， Flor J. S.， Kozlowska J.，， 2021，（14）， 7402

［13］ Shi Z.， Wang Q.， Li G. F.， Shou Y. F.， Zong H. J.， Yan S. F.， Zhang K. X.， Yin J. B.，， 2021，（3）， 327—336

［14］ Lim J. Y. C.， Lin Q.， Xue K.， Loh X. J.，， 2019，， 100021

［15］ Mol E. A.， Lei Z.， Roefs M. T.， Bakker M. H.， Goumans M. J.， Doevendans P. A.， Dankers P. Y. W.， Vader P.， Sluijter J. P. G.，， 2019，（20）， e1900847

［16］ Balavigneswaran C. K.， Muthuvijayan V.，， 2021，（6）， 5362—5377

［17］ Mes T.， Serrero A.， Bauer H. S.， Cox M. A. J.， Bosman A. W.， Dankers P. Y. W.， Meijer E. W.，， 2022，， 175—187

［18］ Webber M. J.， Dankers P. Y. W.，， 2019，（1）， e1800452

［19］ Gao T. T.， Li Z. Y.， Gao G.， Liu F. Q.，.， 2016，（9）， 1744—1749（高婷婷， 李志英， 高歌， 劉鳳岐. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2016，（9）， 1744—1749）

［20］ Ma S. H.， An Y. L.， Wang J. Z.， Song Y. Q.， Liu Y.， Shi L. Q.，， 2017，（10）， 10549—10557

［21］ Takeda S.， Takahashi H.， Sawada S.， Sasaki Y.， Akiyoshi K.，.， 2013，， 25716

Protein Folding Assisted by Covalent Hydrogel Based on Amphiphilic Supramolecular

WANGJiaxin， LIUJia， QINJinmei， NYVMondele Mbola， MENGZihui， XUEMin*

（，，100190，）

A novel monomeric species， 2-｛6-［3-（6-methyl-4-oxo-1，4-dihydropyrimidin-2-yl）ureido］hexylcarbamoyloxy｝ butyl acrylate（UPy-C6-HBA）， was synthesized while 4-hydroxybutyl acrylate（HBA） was introduced to the intermediate compound 2-（6-isocyanatohexyl ureido）-6-methyl-4［1］ pyrimidinone（UPy-C6-NCO） which was obtained through the reaction of 2-aminomethyl-4-hydroxy-6-methylpyrimidine（MIS） with 1，6-hexane diisocyanate（HDI）. UPy-C6-HBA together with acrylamide（AM） and，'-methylenediacrylamide（Bis） was polymerized by UV-induced free radical polymerization method， yielding physically crosslinked hydrogels that possessed a homogenous porous architecture and pronounced swelling capacity. Lysozyme was incorporated within the hydrogel matrix containing UPy-C6-HBA monomer whichrefolding was facilitatedhydrophobic interactions. The effects of UPy-C6-HBA concentration， hydrogel dosage， lysozyme concentration and refolding temperature on the refolding rate of lysozyme were meticulously investigated. Remarkably， the supramolecular hydrogel comprising UPy-C6-HBA at a mass fraction of 15% exhibited a remarkable 41% enhancement in the refolding rate of lysozyme at 25 ℃ compared with the control. These findings unequivocally demonstrate the addition of UPy-C6-HBA monomer to the hydrogel matrix significantly improved the refolding rate of lysozyme， which is of great significance for the refolding of high concentration denatured lysozyme.

2-｛6-［3-（6-Methyl-4-oxo-1，4-dihydropyrimidin-2-yl）ureido］hexylcarbamoyloxy｝butyl acrylate； Supramolecular dual-crosslinked hydrogels； Protein folding； Lysozyme

2023-05-25

薛 敏, 女, 博士, 副教授, 主要從事功能高分子材料和納米水凝膠“人工抗體”材料方面的研究. E-mail: minxue@bit.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21874009)資助.

O633

A

10.7503/cjcu20230250

2023-07-29.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21874009).

（Ed.： W， K， M）