景紅梅,樊海燕,黃小勇,杜 娟,張 靜,慕明濤,史海燕*

(1延安大學醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心,延安 716000;2延安市寶塔區(qū)人民醫(yī)院兒科;3榆林市第一醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:shihaiyan@yau.edu.cn)

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC),又稱為腎腺癌,起源于腎小管上皮,大約70%的腎癌是由透明細胞構(gòu)成的[1]。腎癌分別占男性和女性所有成人惡性腫瘤的5%和3%,是男性第七大常見癌癥,女性第十大常見癌癥,是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤患者死亡的第二大原因[2]。在過去10年中,大多數(shù)國家的RCC發(fā)病率呈上升趨勢,在我國平均年變化百分比達到了7.6%,其中約四分之一患者初診時已有轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)移患者的5年生存率不足10%[3,4]。目前臨床腎細胞癌的主要治療方法包括根治性腎切除術(shù)或部分腎切除術(shù)及熱消融技術(shù),而對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的腎癌患者,療效欠佳[5]。近年來有研究表明,我國傳統(tǒng)藥物在腫瘤防治方面具有獨特的優(yōu)勢[6]。歐前胡素(imperatorin)是一種具有抗菌、抗炎、平喘及抗過敏等多種生物活性的呋喃香豆素,來源廣泛,在一些中草藥中含量豐富,主要用于散風除濕、消膿排腫[7,8]。有研究報道,歐前胡素抗腫瘤作用較顯著,并且對改善腫瘤耐藥有著積極的作用[9,10]。但目前,歐前胡素在腎癌中的研究報道較少見。

隨著大數(shù)據(jù)時代的到來,網(wǎng)絡(luò)藥理學被廣泛應用在中醫(yī)藥研究中。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法和整合策略,可以初步預測中藥潛在靶點及其可能的作用機制[11]。本研究擬采用生物學實驗與網(wǎng)絡(luò)藥理學方法相結(jié)合,從細胞分子水平初步探索歐前胡素治療腎癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人腎透明細胞腺癌細胞(786-O)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,并保存于延安大學醫(yī)學院醫(yī)學實驗研究中心。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 腎癌細胞786-O常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細胞增殖活力及藥物IC50786-O細胞以每孔3×103細胞數(shù)接種于96孔板中,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后加入不同濃度的歐前胡素(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200 μmol/L),同時設(shè)置空白組(僅含有溶劑、細胞培養(yǎng)液和試劑),分別培養(yǎng)24,48,72 h后每孔加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃,5% CO2避光培養(yǎng)1 h,使用酶標儀在450 nm處檢測各處理組OD值,以0 μmol/L為對照組計算細胞存活率。細胞存活率%=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。使用GraphPad Prism7分別計算作用24,48 h歐前胡素對786-O細胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。以log10[歐前胡素濃度(μmol/L)]為橫坐標,細胞抑制率為縱坐標,繪制IC50曲線圖。細胞抑制率(%)=100%-細胞存活率(%)。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察 收集處于對數(shù)生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),以每孔1×104細胞數(shù)接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,以0 μmol/L為對照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,在明場條件下,使用倒置生物學顯微鏡放大100倍觀察各組細胞形態(tài)變化,并拍照。

1.2.4 細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖 收集處于對數(shù)生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),以每孔800個細胞數(shù)接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度歐前胡素(0,40,80 μmol/L),每2 d換液一次。2周后,用PBS洗滌,4%聚合甲醛固定細胞20 min,并用0.1%結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌后拍照。加入二甲基亞砜處理細胞,并在570 nm處測量上清液的吸光度。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集處于對數(shù)生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),以每孔1×104個細胞接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,培養(yǎng)48 h后,用不含EDTA的胰酶消化細胞,收集細胞懸液,使用Annexin Ⅴ/PI雙染色試劑盒進行染色,2 h內(nèi)于流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR分析Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2 mRNA的表達 收集處于對數(shù)生長期的786-O細胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計數(shù),以每孔1×104細胞數(shù)接種到12孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后分別加入0,40,80 μmol/L歐前胡素,培養(yǎng)24 h后,Trizol法提取各組總RNA,按照Removal and cDNA Synthesis實驗操作流程將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以該cDNA為模板,使用KAPA SYBR FAST Universal熒光定量試劑盒及Cobas z 480操作手冊進行擴增檢測,反應采用兩步法,第一步:95 ℃,10 min,1個循環(huán);第二步:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán),各組均設(shè)3個復孔,結(jié)果采用相對定量法2-ΔΔCt進行分析。各引物由西安奧科鼎盛生物公司合成,引物序列見表1。

表1 實驗中所用到的引物序列

1.2.7 Western blot檢測Fas、Caspase-8、Caspse3、Bcl-2的蛋白表達情況 用含有1%全蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解細胞,提取上清,采用BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度。分別取20 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,與特異性一抗(抗人Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bcl-2,比例均為1∶1 000)孵育,4 ℃過夜。洗膜后與二抗室溫孵育1 h,洗膜后與ECL化學發(fā)光劑作用,進行曝光和顯影。GAPDH為內(nèi)參蛋白,用Image J軟件進行蛋白印記的定量分析。

1.2.8 歐前胡素相關(guān)靶點及藥物-疾病共同靶點獲取 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php/)及中藥高通量實驗和參考數(shù)據(jù)庫(HERB,Herb.ac.cn)收集歐前胡素主要作用靶點[12]。通過UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應的基因名稱,并去除重復項。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“renal cell carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索腎癌相關(guān)疾病靶點,并刪除重復項。將腎癌疾病靶點與歐前胡素作用靶點取交集后,導入Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/)系統(tǒng),繪制韋恩圖,獲得歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點。

1.2.9 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://stringdb.org/)將篩選得到的歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。其中參數(shù)Organism選擇“Homo sapiens”,“Minimum required interaction score”選擇“Medium confidence(0.400)”,并隱藏網(wǎng)絡(luò)中未連接的節(jié)點,其他參數(shù)保持默認數(shù)值,篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心作用靶點。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素作用786-O細胞的IC50

歐前胡素作用786-O細胞24 h和48 h的IC50分別為94.36 μmol/L和65.66 μmol/L(見圖1)。

A.歐前胡素作用24 h B.歐前胡素作用48 h

2.2 歐前胡素對腎癌細胞形態(tài)的影響

歐前胡素對腎癌細胞作用24 h后,結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加,細胞體積變小、皺縮,形態(tài)由梭形變得細長,同時細胞密度減少(見圖2)。

圖2 倒置顯微鏡觀察歐前胡素對786-O細胞形態(tài)學的影響 (×100)

2.3 歐前胡素可抑制腎癌細胞786-O的增殖

CCK-8實驗結(jié)果顯示,在同一時間點,隨著歐前胡素濃度的增加,786-O細胞活力降低;在同一濃度作用下,隨著時間的延長,786-O細胞活力降低,呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性(見圖3A)。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗組786-O細胞的克隆形成能力降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖3B)。

圖3 歐前胡素對786-O細胞增殖能力的影響

2.4 歐前胡素促進腎癌細胞786-O凋亡

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組細胞凋亡率均升高(P<0.01);與40 μmol/L組相比,80 μmol/L組細胞凋亡率升高(P<0.01,見圖4)。

圖4 歐前胡素對786-O細胞凋亡的影響

2.5 歐前胡素對腎癌細胞786-O凋亡相關(guān)分子mRNA表達水平的影響

RT-qPCR實驗結(jié)果表明,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組Fas、Caspase-8、Caspase-3在mRNA水平相對表達量均升高(P<0.01),而Bcl-2表達水平上無明顯變化(見圖5)。Western blot實驗結(jié)果表明,與0 μmol/L組相比,40 μmol/L組和80 μmol/L組Fas、Caspase-8、Caspase-3在蛋白水平相對表達量均升高(P<0.05),而Bcl-2表達水平上無明顯變化(P>0.05,見圖6)。

與0 μmol/L組相比,**P<0.01,***P<0.001

與0 μmol/L組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.6 歐前胡素治療腎癌靶點的獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索歐前胡素(MOL001941)作用于8個靶點蛋白。HERB數(shù)據(jù)庫中檢索歐前胡素作用于15個靶點。整合2個數(shù)據(jù)庫平臺篩選得到的所有靶點,刪除重復靶點,共獲得歐前胡素17個靶點基因,結(jié)果見表2。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得腎癌的靶點2 406個。將歐前胡素作用靶點與腎癌疾病靶點通過韋恩圖取交集,得到14個交集靶點,即為歐前胡素治療腎癌的潛在作用靶點(見圖7)。

圖7 歐前胡素作用腎癌潛在靶點

表2 TCMSP及HERB獲得歐前胡素靶點基因

2.7 歐前胡素治療腎癌潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點篩選

將歐前胡素與腎癌的14個共同靶標導入STRING數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,并以置信度≥0.4進行篩選。PPI網(wǎng)絡(luò)共有14個節(jié)點,35條邊。該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點連接度的中位數(shù)是5,因此選擇“Degree≥5”的節(jié)點作為候選靶點。共篩選出7個核心靶點,分別為GSK3β、CDK2、PPARG、ESR1、MAPK14、AR、PTGS2(見圖8),提示其可能是歐前胡素治療腎癌的關(guān)鍵靶點。

淺藍色線條代表來源精選的數(shù)據(jù)庫;粉色線條代表經(jīng)實驗確認;綠色代表相鄰基因;紅色線條代表融合基因;藍色代表共生基因;淺黃色代表文本挖掘基因;黑色代表共表達基因;紫色代表同源性蛋白質(zhì)

3 討論

在治療癌癥中,中醫(yī)藥的使用日益廣泛。大量研究表明,中醫(yī)不僅能緩解癌癥患者的癥狀(如疲勞、慢性疼痛、厭食/惡病質(zhì)、失眠等),提高生活質(zhì)量,還可以減少化療、放療或靶向治療引起的不良反應和并發(fā)癥,提高患者生存質(zhì)量,而且相對于化療藥物,其具有不良反應小、費用低等優(yōu)勢[6]。中藥白芷具有祛病除濕、消腫排膿、活血止痛等功能,其中含有大量歐前胡素[15],國內(nèi)外多項研究表明歐前胡素在抗腫瘤方面具有巨大潛力,例如,歐前胡素可以逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對順鉑類藥物的耐藥性[16];在結(jié)腸癌中,歐前胡素可以通過抑制缺氧誘導因子HIF-1的活化,引起人結(jié)腸癌細胞周期的阻滯,進而抑制腫瘤細胞生長,并阻斷腫瘤血管形成[17]。抑制腫瘤細胞增殖,誘導其凋亡一直是腫瘤治療的一個重要思路[18]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的歐前胡素干預后均能抑制腎癌細胞株786-O細胞的增殖,并呈濃度和時間依賴性。同時本研究發(fā)現(xiàn),40 μmol/L和80 μmol/L的歐前胡素作用24 h后786-O細胞的凋亡率分別達到了27.18%和45.7%,說明歐前胡素可以誘導786-O細胞凋亡,這與Yi等[19]在結(jié)腸癌細胞中的研究結(jié)果一致。本研究的發(fā)現(xiàn)可為歐前胡素在腎癌中的應用提供一定的理論依據(jù)。

細胞凋亡主要有線粒體和死亡受體兩條途徑,死亡受體途徑起始于外部凋亡信號,受跨膜受體的調(diào)節(jié)[20],Fas作為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子受體家族成員,具有信號傳遞功能,當與其配體FasL結(jié)合后,由死亡受體介導的細胞凋亡通路被激活[21],與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)蛋白(FADD)通過死亡效應結(jié)構(gòu)域與Caspase-8前體結(jié)合,形成死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex,DISC),Caspase-8被激活,緊接著凋亡的效應因子Caspase-3被激活,觸發(fā)凋亡執(zhí)行[22]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)歐前胡素作用后,786-O細胞中Fas、Caspase-8和Caspase-3表達均增強,而Bcl-2卻沒有明顯變化。所以我們認為歐前胡素可能是通過Fas/Caspase-8/Caspase-3信號通路誘導786-O細胞凋亡。但有文獻報道,由枳殼中提取的歐前胡素和檸檬苦素聯(lián)合作用肝癌細胞和結(jié)腸癌細胞,可下調(diào)其抗凋亡基因Bcl-2,促進肝癌細胞和結(jié)腸癌細胞的凋亡[23]。這與本研究的結(jié)果不一致,猜測原因可能是歐前胡素的提取原材料不同,也有可能是在不同腫瘤細胞中歐前胡素通過不同凋亡途徑發(fā)揮作用。

系統(tǒng)生物學的快速發(fā)展衍生出了網(wǎng)絡(luò)藥理學以及多種算法、工具、平臺和軟件[12]。這些基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法在中醫(yī)藥相關(guān)研究中得到了廣泛的應用。本研究利用TCMSP和HERB數(shù)據(jù)庫收集歐前胡素作用靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取腎癌相關(guān)靶點。篩選共同靶點后,使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并篩選出歐前胡素治療腎癌的7個核心靶點,分別是GSK3β、CDK2、PPARG、ESR1、MAPK14、AR、PTGS2。有文獻報道,高劑量GSK3β抑制劑可通過上調(diào)Caspase-8、p38α和Fas-Daxx的表達,促進小鼠運動神經(jīng)元-神經(jīng)母細胞瘤雜合細胞(NSC-34)凋亡[14]?；谏飳W實驗、網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果及文獻支持,得出以下結(jié)論,歐前胡素可能通過靶向GSK3β調(diào)控死亡受體途徑,進而抑制腎癌細胞增殖,并促進其凋亡。

綜上所述,本實驗提示了歐前胡素具有誘導腎癌細胞凋亡的生物活性,為腎癌的治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。然而,對于歐前胡素誘導調(diào)控腎癌凋亡的具體作用機制仍未完全闡明。未來研究中我們將會對歐前胡素抗癌的作用機制進行深入的探究。