何金盼,崔 鍵,戴 慶

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,新疆圍術(shù)期器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(XJDX1411),烏魯木齊 830054)

包蟲病作為一種人畜共患疾病,是由寄生在肝臟和肺等器官的細(xì)粒棘球蚴幼蟲導(dǎo)致的嚴(yán)重寄生蟲病[1]。人體感染包蟲后,幼蟲在人體內(nèi)形成囊性包蟲,誘發(fā)囊腫,并釋放包蟲囊液。包蟲囊液所致過敏性休克(anaphylactic shock,AS)是引起患者死亡的主要并發(fā)癥,在臨床實(shí)踐中發(fā)生率高達(dá)2.0%[2]。如果治療不及時(shí),將會(huì)危及生命。

中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞。它們在抵抗細(xì)菌、真菌和寄生蟲病原體的免疫防御中起著至關(guān)重要的作用[3]。2004年Brinkmann等[4]首次報(bào)道稱中性粒細(xì)胞在受到刺激后可形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)。其中,精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)通過催化組蛋白的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,導(dǎo)致染色質(zhì)解凝,這是NETs形成的關(guān)鍵[5]。NETs表面裝飾大量中性粒細(xì)胞胞質(zhì)蛋白和顆粒蛋白,如髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、乳鐵蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等[6]。NETs可以結(jié)合并釋放毒力因子,殺死病原微生物防止其傳播。然而據(jù)研究發(fā)現(xiàn),過度的NETs形成可能導(dǎo)致蛋白水解酶以及組蛋白的大量釋放,從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性,引起過敏反應(yīng)并加重組織損傷[7]。例如在細(xì)菌感染引起的膿毒血癥中,NETs可以加速器官衰竭。而抑制PAD4酶活性可通過抑制NETs產(chǎn)生,提高膿毒癥小鼠生存率[8]。除此之外,機(jī)體過敏期間形成的IgG免疫復(fù)合物(包括組胺和蛋白酶等)可能通過誘導(dǎo)NETs釋放加重過敏反應(yīng)[9]。然而未有研究報(bào)道PAD4介導(dǎo)的NETs是否加重包蟲囊液所致AS,其分子機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

本研究通過給小鼠注射包蟲囊液抗原,構(gòu)建AS模型,通過敲除PAD4抑制NETs形成,觀察是否可以改善模型小鼠癥狀,并研究其分子機(jī)制,以期為包蟲囊液所致AS的臨床防治研究提供一定的參考思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只野生型(wild type,WT)CB7BL/6 PAD4+/+小鼠以及20只同窩PAD4-/-敲除型小鼠(SPF級(jí)),8～10周,體質(zhì)量平均(20.18±2.04)g,均購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(蘇)2018-0019。所有小鼠均置12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中,于24 ℃的恒定溫度中飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)期間可自由獲取標(biāo)準(zhǔn)飲食和水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核,審批號(hào):20220416-062。

1.2 主要儀器和試劑

100×青霉素-鏈霉素溶液(貨號(hào):PB180120)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;紅細(xì)胞裂解液(貨號(hào):C3702)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Percoll細(xì)胞分離液(貨號(hào):17089101)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司;胎牛血清(貨號(hào):C0235)購自美國Gibco公司;RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150110B)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;TRIzol試劑(貨號(hào):abs9331)購自愛必信(上海)生物科技有限公司;M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):MT403-01)購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;SYBR Real-Time PCR試劑盒(貨號(hào):QPG-040)購自上海吉瑪生物科技有限公司;綠箐SYTOX Green(貨號(hào):001-TY9036)購自北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司;離子霉素(貨號(hào):I9657)購自美國Sigma;Picogreen(貨號(hào):12641ES01)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;流式抗體:FITC標(biāo)記的CD4(貨號(hào):ab59474)、PE標(biāo)記的IFN-γ(貨號(hào):ab95673)和APC標(biāo)記的IL-4(貨號(hào):ab95715)購自美國abcam公司;Ficol1分離液(貨號(hào):LDS1075)購自天津?yàn)笊锕?。IL-4、IL-5和IgE的ELISA檢測試劑盒購自上海雨桐生物科技有限公司。

Spark多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司;倒置熒光顯微鏡(型號(hào):TS2)購自尼康儀器(上海)有限公司;7300 Plus Real-Time PCR system、FACSCalibur多色流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 粗制包蟲囊液抗原 于本市屠宰場獲取自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊,取綿羊肝臟。在無菌條件下獲取肝臟中的包蟲囊液,待其自然沉淀后,棄上清液。根據(jù)張秦[10]研究方法,使用含有抗生素(青霉素、鏈霉素各500 U)的生理鹽水沖洗底部沉淀3次。隨后將其凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.3.2 包蟲囊液所致AS模型建立 將小鼠分為WT組、WT模型組、PAD4-/-組和PAD4-/-模型組,每組各10只。WT模型組和PAD4-/-模型組小鼠腹腔注射細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲微囊建立包蟲感染小鼠模型,每只小鼠的注射劑量約為50個(gè)微囊。WT組和PAD4-/-組給予等量生理鹽水代替。1個(gè)月后,將小鼠進(jìn)行全身麻醉,解剖若發(fā)現(xiàn)包蟲囊泡時(shí)則認(rèn)為包蟲囊液模型成功。兩個(gè)模型組小鼠均再次注射相同劑量的包蟲囊液。若小鼠出現(xiàn)喘息,呼吸困難,嘴和尾巴周圍發(fā)紺,甚至表現(xiàn)為震顫和抽搐,則認(rèn)為小鼠出現(xiàn)包蟲囊液所致AS[11]。并記錄小鼠24 h內(nèi)死亡情況。將成功造模的小鼠數(shù)據(jù)納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 脾臟中性粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將小鼠眼球摘除后頸椎脫臼處死,置于75%酒精中浸泡消毒10 min,在無菌環(huán)境下打開小鼠腹腔,取小鼠脾臟,置于1 ml生理鹽水中充分研磨,使用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾,得到脾臟單細(xì)胞懸液。4 ℃,1 000 r/min離心5 min后,棄上清,加入適量紅細(xì)胞裂解液以去除紅細(xì)胞。再次離心棄上清,使用無菌生理鹽水洗滌2次。使用適量生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀,緩慢加入配制好的Percoll細(xì)胞分離液中,室溫1 000 r/min離心30 min。輕輕吸出位于中層的中性粒細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。置于37 ℃,含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.4 qRT-PCR檢測PAD4基因表達(dá) 用TRIzol試劑從中性粒細(xì)胞中提取總RNA,并使用酶標(biāo)儀檢測RNA質(zhì)量(濃度、純度)。使用M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照SYBR Real-Time PCR試劑盒的說明配制qRT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt值比較各組之間目的基因的相對(duì)表達(dá)量,以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列如下:PAD4上游引物:5′-TTCAAGTGGTGGCACATGGT-3′,下游引物:5′-AGATCTCTTGCTGCACCTCG-3′;GAPDH上游引物:5′-CAGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′;下游引物:5′-GATGGGCTTCCCGTTGATGA-3′。

1.3.5 綠菁染色法檢測NETs形成水平 綠箐SYTOX Green是一種可輕易穿過受損細(xì)胞質(zhì)膜而不能透過活細(xì)胞質(zhì)膜的綠色核酸染料,可用來檢測NETs的DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。將提取的脾臟中性粒細(xì)胞均勻鋪于24孔板內(nèi),每孔1×106個(gè)細(xì)胞,在避光條件下,加入細(xì)胞核染料綠箐(1 μmol/L),輕輕混勻,孵育10 min,在含有氬激光488 nm激發(fā)器的熒光顯微鏡下觀察,使用Image J軟件對(duì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.6 NETs與外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共孵育 提取健康小鼠的脾臟中性粒細(xì)胞,以1×106的密度接種于24孔板中,加入10 μmol/L的離子霉素刺激3 h后,棄掉上清液,加入新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,輕輕吹起中性粒細(xì)胞,在1 000 r/min下離心5 min,獲取的上清液,采用picogreen熒光染料檢測雙鏈DNA的濃度,即為NETs含量。收集健康WT小鼠的外周血,Ficol1密度梯度離心法分離PBMC均勻平鋪于24孔板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加NETs)和NETs組,NETs組加入200 μg/ml濃度的NETs后,置于37 ℃,含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育24 h后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1/Th2細(xì)胞比例 分別抽取造模組和對(duì)照組外周靜脈血,Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。分別加入FITC標(biāo)記的CD4抗體10 μl,混勻,室溫放置20 min對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。Triton通透并固定細(xì)胞后進(jìn)行PBS洗滌,進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,實(shí)驗(yàn)管分別加入PE標(biāo)記的IFN-γ抗體和APC標(biāo)記的IL-4抗體各10 μl,對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體,4 ℃避光孵育30 min后,PBS洗滌2次后,采用流式細(xì)胞儀檢測分析。用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 ELISA檢測血清中IL-4、IL-5和IgE蛋白的含量 參考ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行IL-4、IL-5和IgE的含量檢測。依次制備梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品后加入標(biāo)準(zhǔn)孔中,加入10 μl待測樣品與40 μl樣品稀釋液,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min。加入50 μl的辣根過氧化物酶標(biāo)試劑,繼續(xù)37 ℃反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后,分別加入顯色液A和顯色液B,室溫反應(yīng)10 min后可觀察明顯顏色變化。加入終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 敲除PAD4緩解包蟲囊液所致AS癥狀

與WT組比較,WT模型組小鼠休克率和死亡率明顯升高;與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠休克率和死亡率明顯降低(見表1)。

表1 敲除PAD4對(duì)包蟲囊液所致AS癥狀的影響 例(%)

2.2 敲除PAD4抑制包蟲囊液所致NETs形成

qRT-PCR結(jié)果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠脾臟中中性粒細(xì)胞PAD4 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠脾臟中中性粒細(xì)胞PAD4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠脾臟中中性粒細(xì)胞PAD4 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。綠菁染色結(jié)果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠NETs形成水平升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠NETs形成水平降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠NETs形成水平無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。

2.3 敲除PAD4恢復(fù)包蟲囊液所致Th1/Th2細(xì)胞比例失衡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠PBMC中Th2細(xì)胞比例升高,Th1/Th2細(xì)胞比例降低(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠PBMC中Th2細(xì)胞比例降低,Th1/Th2細(xì)胞比例升高(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠PBMC中Th2細(xì)胞比例和Th1/Th2細(xì)胞比例無顯著性差異(P>0.05,見圖2)。

與WT組比較,*P<0.05;與WT模型組比較,#P<0.05

2.4 敲除PAD4緩解包蟲囊液所致過敏性反應(yīng)

ELISA結(jié)果顯示,與WT組比較,WT模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05);與WT模型組比較,PAD4-/-模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平降低(P<0.05);PAD4-/-組和PAD4-/-模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平無顯著性差異(見圖3)。

2.5 NETs誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞比例失衡和過敏性反應(yīng)

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,NETs組Th2細(xì)胞比例升高,Th1/Th2細(xì)胞比例降低(P<0.05,見圖4)。ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,NETs組細(xì)胞上清中IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05,見圖5)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05

與對(duì)照組比較,*P<0.05

3 討論

包蟲病是細(xì)粒棘球蚴幼蟲侵入人體引起的寄生蟲病。在手術(shù)過程或者發(fā)生外傷時(shí),包蟲原頭節(jié)會(huì)脫落并擴(kuò)散至腹腔或其他器官中,形成新的包囊,導(dǎo)致疾病反復(fù)發(fā)作。此外,包蟲囊液感染形成的囊腫可能發(fā)生破裂,進(jìn)而導(dǎo)致AS,在臨床嚴(yán)重程度和免疫學(xué)特征上均不同于Ⅰ型超敏反應(yīng)[12]。因此,臨床上針對(duì)Ⅰ型超敏反應(yīng)的治療,往往無法治愈包蟲囊液所致的AS,這給臨床治療帶來了很大困難[13]。

中性粒細(xì)胞是發(fā)生炎癥或感染后快速募集并殺死病原微生物的一類免疫細(xì)胞。在人類包蟲病中,中性粒細(xì)胞在包囊中大量浸潤[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)綿羊的中性粒細(xì)胞體外接觸包蟲原頭節(jié)后,可以觸發(fā)NETs形成[15]。這表明中性粒細(xì)胞除了可以通過吞噬、釋放炎性因子等經(jīng)典功能發(fā)揮作用外,還可能通過釋放NETs對(duì)抗寄生蟲感染疾病。目前針對(duì)NETs產(chǎn)生的機(jī)制已經(jīng)有大量研究進(jìn)行了報(bào)道。中性粒細(xì)胞在受到刺激后,細(xì)胞膜上的Ca2+通道打開,細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流至細(xì)胞質(zhì)中,導(dǎo)致PAD4酶被激活[16]。PAD4是PAD家族中唯一攜帶核定位信號(hào)的酶[17]。在被激活之后,PAD4進(jìn)入細(xì)胞核,催化染色質(zhì)上的組蛋白發(fā)生瓜氨酸化。這一過程使得組蛋白的正電荷減弱,降低了它們與DNA的靜電結(jié)合能力,從而導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定,出現(xiàn)解螺旋。隨后,DNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,并與髓過氧化物酶(MPO)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)等細(xì)胞質(zhì)顆粒蛋白結(jié)合。這個(gè)復(fù)合物隨后被從細(xì)胞中釋放出來,形成被稱為NETs的結(jié)構(gòu)[18]。NETs形成受各種因素的影響,包括細(xì)胞的黏附、代謝和環(huán)境刺激,細(xì)菌和病毒往往會(huì)被中性粒細(xì)胞的吞噬作用清除,而寄生蟲更傾向于誘導(dǎo)NETs的形成[19]。Mendez等[20]在牛的奧氏奧斯特線蟲慢性感染疾病中觀察到了NETs的產(chǎn)生,同時(shí)研究表明,寄生蟲觸發(fā)的NETs形成可能反映了宿主針對(duì)寄生蟲入侵的早期先天免疫反應(yīng)應(yīng)答,以此對(duì)抗寄生蟲感染[21]。以上研究證據(jù)均表明NETs可能是對(duì)抗寄生蟲感染的關(guān)鍵,然而并未曾有進(jìn)一步的機(jī)制探索。

值得注意的是,目前越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),PAD4介導(dǎo)的NETs形成可以加重諸如COVID-19等多種感染性疾病的發(fā)展[21]。在COVID-19感染者中,NETs在患者肺部大量浸潤。體外實(shí)驗(yàn)表明NETs可對(duì)正常肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,而用脫氧核糖核酸酶抑制NETs后可以逆轉(zhuǎn)這種損傷[22]。在本實(shí)驗(yàn)中,通過使用WT和PAD4敲除的小鼠進(jìn)行腹腔注射包蟲囊液進(jìn)行造模,探究PAD4介導(dǎo)的NETs形成是否會(huì)加重由包蟲感染導(dǎo)致的AS,結(jié)果表明,敲除PAD4緩解包蟲囊液所致AS癥狀,表現(xiàn)為休克率和死亡率明顯降低。同時(shí)敲除PAD4抑制了小鼠中性粒細(xì)胞NETs的形成,提示NETs可能在包蟲囊液所致AS中過度產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)了該疾病的惡化。

Th1/Th2細(xì)胞的平衡與免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)密切相關(guān)。Th1/Th2失衡時(shí),Th2細(xì)胞分化增加導(dǎo)致過敏反應(yīng)加重[23]。因此調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡對(duì)包蟲囊液所致AS具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),WT模型組小鼠PBMC中Th1/Th2細(xì)胞比例降低,而敲除PAD4可以顯著增加Th1/Th2細(xì)胞比例。同時(shí)NETs與PBMC共孵育實(shí)驗(yàn)表明,NETs可直接調(diào)節(jié)Th1/Th2比例,以上結(jié)果表明PAD4介導(dǎo)的NETs可能通過加重Th1/Th2細(xì)胞比例的失衡加重疾病進(jìn)程。Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)是抗炎反應(yīng),IL-4和IL-5為Th2型細(xì)胞因子,它們可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體,繼而刺激肥大細(xì)胞釋放組胺,引起過敏反應(yīng)[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NETs可以增加PBMC的IL-4、IL-5和IgE分泌能力,而PAD4敲除可以顯著抑制小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平的升高,緩解包蟲囊液所致過敏性反應(yīng)。

綜上所述,敲除PAD4可以通過抑制中性粒細(xì)胞NETs的形成,改善包蟲囊液所致AS。PAD4敲除可能通過恢復(fù)包蟲囊液所致Th1/Th2細(xì)胞比例失衡,抑制包蟲囊液所致過敏性反應(yīng)進(jìn)而緩解包蟲囊液所致AS。以上結(jié)果初步明確了PAD4介導(dǎo)的NETs形成在包蟲囊液所致AS中的作用,可為其臨床治療提供可能的治療靶點(diǎn)。