胥騰，黃海輝

綜 述

艱難梭菌抗菌藥物耐藥機制研究進展

胥騰，黃海輝

復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，國家衛(wèi)健委抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040

艱難梭菌(，CD)是醫(yī)療機構感染性腹瀉最常見的病原之一，并被美國疾病控制和預防中心列為需要緊急和積極應對的耐藥威脅。許多耐藥基因可在醫(yī)療機構、社區(qū)和自然環(huán)境中不同菌種間轉移，隨著新耐藥機制的產(chǎn)生與獲得，CD的抗微生物藥物耐藥性(antimicrobial resistance，AMR)也在不斷演變。CD的耐藥機制多種多樣，包括化學修飾造成失效、藥物靶點的修飾以及藥物的主動外排等。既往CD對大環(huán)內脂類和喹諾酮類藥物耐藥性及耐藥機制研究較為充分，但對甲硝唑、萬古霉素等艱難梭菌感染(infection，CDI)治療藥物的耐藥機制研究尚處于起步階段。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些既往CD研究中未考慮的機制如質粒介導的耐藥，同樣可能在艱難梭菌AMR中發(fā)揮重要作用。本文主要綜述了CD對甲硝唑、萬古霉素和非達霉素等治療用抗菌藥物的耐藥機制研究進展，以期為CDI的防治與新抗菌藥物和新耐藥菌檢測試劑盒的研發(fā)提供參考。

艱難梭菌；耐藥機制；甲硝唑；萬古霉素

抗微生物藥物耐藥(antimicirobial resistance，AMR)是全球公共衛(wèi)生面臨的重要威脅[1]。艱難梭菌(，CD)是一種重要的多重耐藥菌，常對大環(huán)內酯類、林可酰胺類、四環(huán)素類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類呈多重耐藥[2]。該特征使得CD能夠在應用廣譜抗菌藥物導致腸道菌群失調時進行優(yōu)勢生長、產(chǎn)生毒素從而造成艱難梭菌感染(infection，CDI)，同時其產(chǎn)芽孢的特性可造成CD在醫(yī)療機構內的廣泛傳播[3]。從2013年開始，CD就被被美國疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)列為最緊迫的公共衛(wèi)生威脅，每年給美國醫(yī)療保健系統(tǒng)造成 10 億美元的損失[4,5]。至2019年美國CDC仍將其納入五大抗生素耐藥性緊急威脅之一。

當前臨床上推薦治療CDI的抗菌藥物有甲硝唑(metronidazole，MTZ)、萬古霉素(vancomycin)和非達霉素(fidaxomicin)[6～8]。除此之外，有研究表明替加環(huán)素(tigecycline)可有效治療重度CDI[9]，利福昔明(rifaximin)可能有助于預防CDI復發(fā)[10]。然而，近年來發(fā)現(xiàn)CD對這些藥物的敏感性較前下降。來自美國休斯頓的一項研究結果顯示CDI患者糞便分離株中26%對萬古霉素不敏感，29%對MTZ不敏感；而在肯尼亞內羅畢進行的另外一項研究顯示對二者不敏感的分離株比例可高達67%和85%[11]。與此同時，這兩種藥物治療失敗的報道也并不少見。在國內，艱難梭菌不屬于CARSS和CHINET細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測病原菌范疇，但某些小規(guī)模流行病學研究仍然提示耐藥菌株的存在。Meta分析顯示2007～2013年間我國臨床來源艱難梭菌對利福平的耐藥率為18.3%，對四環(huán)素的耐藥率為46.8%，對甲硝唑和萬古霉素則完全敏感[12]。浙江杭州兩所三甲醫(yī)院2012～2015年間腹瀉患者糞便l來源的411株艱難梭中有15.6%對甲硝唑耐藥， 36.3%對四環(huán)素耐藥，所有菌株均對萬古霉素敏感，且產(chǎn)毒株的多重耐藥率(96.4%)遠高于非產(chǎn)毒菌株(31.4%)[13]。

艱難梭菌對抗菌藥物耐藥機制是多種多樣的(圖1)。細菌對抗菌藥物主要的幾類耐藥機制在艱難梭菌中均比較常見[14]。艱難梭菌可通過改變藥物結構造成抗菌藥物失效：例如通過轉座子Tn4453a和Tn4453b上攜帶的編碼的氯霉素乙酰轉移酶，對氯霉素伯羥基進行乙?；揎棇е滤幬锸o法與細菌50S核糖體亞基結合；此外某些CD菌株編碼 D類β-內酰胺酶可破壞β-內酰胺環(huán)使頭孢菌素類藥物失去活性。艱難梭菌還可對抗菌藥物靶點進行修飾：例如操縱子的表達可造成CD肽聚糖前體末端d-Ser修飾，使該位點與萬古霉素的親和力降低。迄今為止，在CD臨床株RpoB利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determining region，RRDR)中也已發(fā)現(xiàn)十余種耐藥突變，可能阻礙利福霉素類藥物與靶點RpoB蛋白的結合。艱難梭菌編碼不同家族的轉運蛋白對抗菌藥物進行主動外排：例如CD中編碼的MATE家族轉運蛋白與氟喹諾酮耐藥有關，而ABC家族轉運蛋白CprABC介導了CD對抗微生物肽的耐藥性。生物膜的形成同樣參與了艱難梭菌對藥物的耐受：亞抑菌濃度的萬古霉素和甲硝唑可增強CD生物膜的形成，同時CD生物膜又可耐受更高濃度的甲硝唑(10～100 mg/L)和萬古霉素(20 mg/L)。除此之外，一些既往未考慮的機制如可轉移質粒介導的耐藥(推測編碼N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的萬古霉素耐藥質粒pX18-498，甲硝唑耐藥質粒pCD-METRO等)，同樣可能在艱難梭菌AMR中發(fā)揮重要作用。本文主要對常用治療CDI藥物(甲硝唑、萬古霉素、非達霉素、利福昔明和四環(huán)素類等)的耐藥機制的研究進展展開綜述，以期為臨床治療和新藥研發(fā)提供參考。

圖1 艱難梭菌對臨床常用CDI治療抗菌藥物的耐藥機制

艱難梭菌的甲硝唑耐藥機制包括質粒pCD-METRO的水平轉移和內源基因(如鐵轉運蛋白編碼基因等)的突變。萬古霉素耐藥則可由質粒pX18-498或vanG操縱子介導，當vanG操縱子過表達時D-Ser可取代D-Ala對肽聚糖進行末端修飾。和的突變以及同源基因的突變可導致艱難梭菌對非達霉素敏感性降低。來自抗菌藥物選擇壓力、群體感應信號和基因共同調節(jié)艱難梭菌生物膜形成，對甲硝唑和萬古霉素的敏感性降低。外排泵同樣參與了抗菌藥物耐藥，例如630Δ菌株中ATP結合盒轉運蛋白CD2068的缺失導致其對甲硝唑的IC50上升1.4倍。

1 甲硝唑

MTZ是硝基咪唑類抗生素，自20世紀90年代末以來一直是治療輕中度CDI的首選藥物。然而，自從流行毒株NAP1/027出現(xiàn)后[15]，許多國家陸續(xù)報道了對MTZ低水平耐藥和異質性耐藥的菌株，近年來甚至分離到高水平耐藥株。對MTZ治療響應降低的CDI病例報道也越來越多見。

MTZ是一種前體藥物，攝入菌體后，在胞內經(jīng)厭氧菌特有的低氧化還原電位酶促反應還原激活，雜環(huán)裂變后形成羥乙基肟酸和乙酰胺[16]。MTZ的殺菌機制尚不明確，可能為活化反應伴隨生成的硝基自由基對厭氧菌產(chǎn)生細菌毒性，造成細菌死亡[16]。

CD對MTZ耐藥亦可能涉及多種機制，其一是藥物還原激活通路的改變。參與藥物氧化還原反應的電子傳遞蛋白如丙酮酸黃多辛氧化還原酶PFOR等在該酶促反應中發(fā)揮了重要作用，這類蛋白編碼基因的突變參與了耐藥形成。Lynch等[17]對一株臨床來源的異質性耐藥CD分離株CD26A54通過體外誘導獲得MTZ穩(wěn)定耐藥株CD26A54-R (MIC=12～ 256 mg/L)。對該耐藥株進行基因組和蛋白質組學分析表明，編碼的甘油-3-磷酸脫氫酶(Ala229Thr)，以及編碼的PFOR(Gly423Glu)均存在突變[17]。這些突變很可能使電子傳遞中斷，從而改變菌體能量代謝和胞內氧化還原電位，進而影響MTZ主動轉運和胞內還原激活的效率。這些電子傳遞中斷或缺陷的細菌往往表現(xiàn)為小菌落變異(small colony variant，SCV)，具有菌落較小、生長緩慢、呼吸減少、菌體分離減弱和對抗生素耐藥等特點[18,19]。作者通過掃描電子顯微鏡觀察CD26A54-R菌落同樣存在上述特征，符合電子傳遞功能缺陷的表現(xiàn)。另一項體外研究進一步證實了電子傳遞蛋白PFOR對CD的MTZ耐藥有重要作用，Deshpande等[20]收集了491858，490054和上述CD26A54-R三株存在PFOR突變的MTZ耐藥的CD菌株。其中491858和490054菌株的MTZ MIC均為8～16 mg/L，且PFOR存在Ala1018Val突變。數(shù)據(jù)庫比對顯示該氨基酸突變位點緊鄰蛋白的4Fe-4S輔因子接合部。作者對三株菌分別回補了野生型PFOR編碼基因及其啟動子，發(fā)現(xiàn)回補株的MTZ MIC為4～8 mg/L，顯著低于回補前親本株(<0.05)[20]。然而，由于對CD胞內MTZ激活代謝產(chǎn)物(如還原性亞硝酸鹽、NO、乙酰胺)濃度的定量檢測均未能成功，因此PFOR突變是否通過阻止MTZ胞內還原激活而導致耐藥產(chǎn)生尚未確定。

鐵離子作為組成PFOR等電子傳遞蛋白功能性輔基(如含鐵硫簇)的重要元素，在MTZ還原激活途徑中發(fā)揮重要作用，因此鐵代謝/穩(wěn)態(tài)的變化也被認為與CD對MTZ耐藥有關。Moura等[21]對一株臨床分離RT10型不產(chǎn)毒MTZ耐藥株(MIC=32 mg/L)進行了蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)在MTZ暴露期間耐藥株中鐵蛋白缺失。Lynch等[17]對上述CD26A54-R菌株通過蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，MTZ暴露后亞鐵離子轉運蛋白FeoB1表達水平下降2.2倍，鐵化合物ABC轉運蛋白底物接合蛋白(CDR20291_1548)表達水平下降1.7倍，提示在耐藥菌株中可能存在鐵攝取減少。同時這些菌株表現(xiàn)出適應性缺陷，需要在培養(yǎng)基中加入鐵以幫助生長。Deshpande等[20]通過敲除DNA錯配修復基因構建了一株可高度突變的CD菌株，以研究其體外MTZ誘導耐藥的基因演變，該研究中菌株對MTZ的體外耐藥性是逐步發(fā)展的，MIC從2 mg/L增加到16 mg/L。作者發(fā)現(xiàn)截斷的亞鐵轉運蛋白FeoB1是產(chǎn)生低水平抗性的第一步，隨后發(fā)生的是突變，繼而出現(xiàn)(黃嘌呤脫氫酶編碼基因)突變和(一種鐵硫簇調節(jié)因子)突變，導致更高水平的MTZ抗性(MIC=64 mg/L)。在CD中，F(xiàn)eoB1是主要的鐵轉運蛋白，作者證實在ATCC 700057中的突變降低了菌體內鐵含量，使細菌轉而利用黃素氧還蛋白(flavodoxin)進行能量代謝，黃素氧還蛋白電子傳遞效率遠低于鐵氧環(huán)蛋白(ferredoxin)因此可能造成MTZ還原激活速率降低。和基因的突變雖然提高了MTZ的MIC，但在沒有發(fā)生突變的情況下不能獨自介導菌株產(chǎn)生耐藥性，相反僅存在缺失的菌株即可表現(xiàn)出低水平的MTZ耐藥[20]。然而在體內該機制是否同樣有意義仍有爭議，因為FeoB1對CD定植和毒力的產(chǎn)生至關重要，CDI小鼠中CD的上調200倍，因而能定植并感染機體的CD不太可能自發(fā)篩選富集出FeoB1突變[22]。事實上，在目前已有的臨床分離MTZ耐藥株中，也沒有發(fā)現(xiàn)FeoB1突變的菌株。

Olaitan等[23]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)甲硝唑耐藥艱難梭菌的耐藥表型較為獨特，耐藥菌僅在含血紅素瓊脂板上才表現(xiàn)出甲硝唑耐藥，而在普通瓊脂板上耐藥表型消失。研究發(fā)現(xiàn)，這些艱難梭菌菌株在基因的啟動子中存在T-to-G突變(作者稱之為PnimBG)，從而導致的組成型轉錄。沉默或敲除后，這些MTZ耐藥株的耐藥表型消失。NimB是一種血紅素依賴的黃素酶，可降解硝基咪唑類抗菌藥物使其喪失抗菌活性。此外，作者發(fā)現(xiàn)PnimBG突變的發(fā)生似乎與DNA聚合酶的Thr82Ile突變有關，而后者已被證實可介導艱難梭菌對氟喹諾酮類抗菌藥耐藥。該研究結果表明，對氟喹諾酮耐藥的艱難梭菌菌株中可能也有部分菌株同時對甲硝唑的敏感性降低。

Boekhoud等[24]發(fā)現(xiàn)質粒也可介導MTZ耐藥，他們從MTZ治療失敗的CDI患者糞便標本CD臨床分離株中(RT 020)發(fā)現(xiàn)了一種約7 kb大小的高拷貝質粒(pCD METRO)，攜帶該質粒使CD對MTZ產(chǎn)生耐藥性，將pCD METRO質粒轉化敏感株后MIC增加可超過24倍。流調顯示該質粒僅存在于MTZ耐藥的菌株的中，該研究在585株CD中發(fā)現(xiàn)3.8%的菌株攜帶pCD METRO，攜帶質粒的菌株來自不同歐洲國家，并屬于不同核糖體分型(RT027、010和020)。然而，該質粒介導MTZ抗性的確切機制尚不明確。該質粒含有一個與脆弱擬桿菌基因同源的小假基因(small pseudogene)，但該基因缺乏編碼催化結構域，在實驗室菌株中誘導該基因高表達也不會介導耐藥。攜帶該質粒不會造成菌株的生長速率降低，且耐藥菌株在非選擇性培養(yǎng)基上重復傳代也不會丟失該質粒。該質粒的鳥嘌呤胞嘧啶含量(GC%)為41.6%，與染色質的標準值(約28%～30%)不匹配，表明該質粒是艱難梭菌通過水平轉移從另一種未知生物體處獲得[24]。

除上述已被驗證的耐藥機制之外，在暴露于MTZ的耐藥菌株中還檢測到DNA修復蛋白RecA的差異表達[21,25]。在其他菌種中，具有DNA修復缺陷的突變株對MTZ更敏感[17]。在耐藥菌株中也發(fā)現(xiàn)了氧化應激相關蛋白的差異表達[23]，硫胺素合成酶()和甘油-3-氧化還原酶()基因的突變也與CD的耐藥性相關。另一株RT010耐藥臨床分離株中存在372位突變造成編碼蛋白的碳端結構缺失[26]。但是這些基因突變或表達水平變化在MTZ耐藥中發(fā)揮的作用尚未經(jīng)實驗室研究確認。

艱難梭菌對甲硝唑耐藥可能與甲硝唑的臨床療效下降有關。近期研究表明，艱難梭菌對MTZ MIC≥1 μg/mL是基于MTZ的初始治療方案臨床治療失敗的獨立預測因素[27]。來自美國與歐洲的兩個多中心隊列RCT研顯示甲硝唑標準方案下CDI初始治療失敗率接近30%，且后續(xù)出現(xiàn)CDI復發(fā)的概率總體達到23%，兩項指標均劣于萬古霉素。因此近5年歐洲和美國指南中MTZ地位有所下降，僅推薦用于治療不能耐受或無法獲得萬古霉素/非達霉素的輕中度CDI初次發(fā)作患者。

2 萬古霉素

最常見的萬古霉素耐藥機制是基因介導的藥物靶點修飾，造成萬古霉素與細胞壁親和力降低[28]。系列基因主要介導d-Lac或d-Ser兩種末端修飾。其中，d-Lac修飾(d-Ala-d-Lac)由和基因簇編碼，可造成高水平萬古霉素抗性；d-Ser修飾(d-Ala-d-Ser)由、和基因簇編碼，可造成低水平抗性。目前已在CD中鑒定出多個同源基因，包括和，并且與萬古霉素MIC的升高相關[29～31]。這些基因的表達由雙組分調節(jié)系統(tǒng)控制，該系統(tǒng)包含組氨酸激酶VanS和反應調節(jié)子VanR[32]。VanS通常識別萬古霉素的存在，導致自身磷酸化并將其磷酸基團轉移到VanR，隨后，磷酸化的VanR結合到啟動子區(qū)域以誘導的轉錄。有研究顯示約85%的CD攜帶基因[31]，但與萬古霉素耐藥的關系仍不明確。Ramírez-Vargas等[30]分析了哥斯達黎加當?shù)蒯t(yī)院流行的(NAPCR1型) 38個分離株，發(fā)現(xiàn)所有分離株都具有樣序列，但其中只有四個分離株萬古霉素耐藥(MIC= 4 mg/L)。有學者對此做出解釋，認為存在其他調控機制使得在敏感株中保持沈默[30,33,34]。有研究在萬古霉素耐藥CD臨床菌株(MIC=4～8 mg/L)以及實驗室誘導突變株(MIC=8～ 16 mg/L)中發(fā)現(xiàn)，原先沉默的vanG發(fā)生組成性表達，原因是這些菌株攜帶的調控vanG的雙組分系統(tǒng)發(fā)生了兩處突變[31]。該研究對參考菌株R20291進行連續(xù)傳代構建萬古霉素耐藥株(MIC=8～16 mg/L)，這些耐藥株的都發(fā)生了突變。然后作者又分析了11株萬古霉素MIC升高(4～ 8 mg/L)的臨床株，發(fā)現(xiàn)它們存在相似的突變，導致組成型高表達[31]。其一是調節(jié)蛋白VanR中的Thr115Ala突變使得VanR持續(xù)處于DNA結合構象，從而更易誘導vanG的轉錄。近期研究顯示該位點突變與2016年美國佛羅里達州艱難梭菌臨床分離株對萬古霉素的MIC增加有關[35]。其二是組氨酸激酶VanS保守區(qū)域的突變（Arg314Leu），該區(qū)域影響了VanS的磷酸酶活性，因此可能增加VanR的磷酸化水平。

除基因外，萬古霉素耐藥CD中也發(fā)現(xiàn)了、、和等同源基因的存在，但這些基因與耐藥關系仍不明確。Saldanha等[32]對巴西 7 株萬古霉素耐藥臨床分離CD進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)有五株存在至少一個基因。然而，對萬古霉素敏感的兩個分離株也含有和基因，這表明單獨存在基因與萬古霉素耐藥性無關[32]。未來需要對基因的表達水平以及誘導其表達的上游調控機制進行深入研究，以解釋這些基因與萬古霉素耐藥性的關聯(lián)。

多藥外排泵是存在于細菌細胞膜中的主動轉運蛋白，其中一個主要家族是ATP結合盒(ATP- binding cassette，ABC)轉運蛋白，水解ATP供能，對簡單離子或大分子的溶質如抗菌藥物進行轉運外排[36]。已有研究在幾種梭狀芽孢桿菌中證實轉運蛋白是造成多藥耐藥的主要原因[37,38]。在CD中，陽離子抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP)可誘導ABC轉運蛋白操縱子高表達，從而降低各種 CAMP的有效性[39]。Ngernsombat等[40]發(fā)現(xiàn)并驗證了多藥外排泵ABC轉運蛋白CD2068。作者參考 CD630菌株的基因組分析確定CD2068與和[37,38]中的其他兩個已知 ABC轉運蛋白具有高度同源性。在暴露于萬古霉素 (0.25 mg/L)后基因表達水平顯著增加。在大腸埃希菌中過表達CD2068使萬古霉素對大腸埃希菌的半數(shù)最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)升高2.6倍。然而，在敏感模式株CD630Δ中敲除、回補，未觀察到萬古霉素IC50的顯著差異。CD2068造成CD對多藥耐藥性能力減弱的原因尚不清楚，但作者提出了幾種假設，如CD敏感株中CD2068的表達水平較低；其他ABC轉運蛋白的代償；和/或其他機制介導某些抗生素耐藥。CD630基因組中共有243處基因經(jīng)預測編碼ABC轉運蛋白[41]，因此需要進行更多的研究來確定CD2068或其他轉運蛋白在CD對萬古霉素耐藥中的作用及機制。

細胞壁蛋白66()基因編碼艱難梭菌的細胞表面抗原，既往研究顯示Cwp66在細胞粘附中起重要作用。Zhou等[42]發(fā)現(xiàn)Cwp66編碼基因缺失的艱難梭菌菌株與野生株相比，對克林霉素、氨芐青霉素和紅霉素更加敏感，但對萬古霉素和甲硝唑的敏感性降低。但突變造成敏感性降低的具體機制尚不明確。

生物膜可作為物理屏障抑制宿主免疫反應并阻止足夠濃度的抗菌藥物到達感染部位，與多種病原菌的耐藥性、耐受性及反復感染有關[43～45]。目前有兩項研究表明CD生物膜的形成與萬古霉素敏感性降低有關[46,47]。Dapa等[46]測定了兩株CD (CD630和R20291)的生物膜生長，發(fā)現(xiàn)在暴露于20 mg/L萬古霉素(100倍MIC)后，與浮游CD相比，一日和三日齡生物膜中的CD菌株存活率分別升高5倍和12倍。Tijerina-Rodriguez 等[47]研究發(fā)現(xiàn)與浮游細菌相比，生物膜中CD的萬古霉素 MIC 升高100倍。盡管生物膜已被證明與萬古霉素MIC的增加和CDI復發(fā)有關，但CD生物膜的形成是多因素的，涉及細胞壁表面因子、運動纖毛、芽孢生成和群體感應等多種機制，目前的研究還不能明確地將任何一種機制與萬古霉素耐藥聯(lián)系起來。

與MTZ耐藥相似，質粒介導的水平轉移同樣可造成CD的萬古霉素耐藥。最近有研究報道來自萬古霉素治療無效患者的分離株中存在由質粒介導的萬古霉素敏感性降低(MIC=2 mg/L)[48]。該質粒pX18-498是一個具有51個ORFs的大型質粒，包括一個推測編碼N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸氨基酶(一種肽聚糖重塑酶)的基因。該酶對于以細胞壁為靶點的抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生至關重要，將帶有該酰胺酶編碼基因的pX18-498質粒轉化入CD可導致細菌的滲透脆性降低。此外，感染攜帶pX18-498的CD菌株的小鼠比感染缺乏該質粒的同基因背景菌株的小鼠疾病程度更加嚴重。作者認為pX18-498對耐藥機制的影響，以及該質粒與細菌染色質基因組之間是否存在相互作用仍需要進一步研究。

考慮到萬古霉素耐藥質粒pX18-498在非產(chǎn)毒株中也有攜帶，且艱難梭菌可在人體腸道內定植，在1歲以下幼兒腸道中定植概率達70%，而在成人腸道中概率在2%～15%，因此盡早識別可能的帶菌者，通過PCR等手段篩查是否攜帶pX18-498耐藥質粒，或許能夠對萬古霉素耐藥的艱難梭菌及其造成的感染進行早識別、早治療。

3 非達霉素

窄譜抗菌藥物非達霉素與細菌RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)的夾型結構域結合，抑制DNA轉錄的起始步驟[49]。自2011年起，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準非達霉素用于治療CDI。非達霉素耐藥的CD (MIC=16 μg/mL)是從一名接受非達霉素治療的 rCDI 患者的糞便標本中分離得到的[50]。非達霉素耐藥性源于RNAP結合位點的突變，包括RpoB (Gln1074Lys，Val1143Asp、Gly、Phe)和RpoC (Gln781Arg，Asp1127Glu，Asp237Tyr)等多種突變[51,52]。其中，Val1143Asp (MIC>64 mg/L)和Val1143Gly (MIC=16 mg/L)也存在于非達霉素耐藥的臨床分離CD菌株中[52,53]。RpoB的Val1143Asp突變會影響CD的適應性和毒力[53]。Val1143Asp、Val1143Gly突變的實驗室菌株與其親本菌株R20291相比，整體生長變緩、競爭適應性下降且毒素A和B的產(chǎn)生均減少，在CDI 金黃地鼠模型中其毒力也降低。研究人員對這些 RNAP存在突變的耐藥株的臨床意義進行了分析，認為目前尚不清楚這批耐藥株是否能在治療濃度的非達霉素中存活(據(jù)報道非達霉素的糞便治療濃度可達1396 ± 1019 μg/g)[54]。此外，由于這類耐藥突變伴隨著適應性降低，且非達霉素的窄譜活性對腸道微生物群影響較小[55]，因此如果在治療過程中出現(xiàn)耐藥突變，共生的多種腸道微生物群可能有助于減輕突變帶來的影響。體外誘導的非達霉素耐藥突變株(MIC=16 mg/L)的基因存在移碼突變，是(多重抗生素抗性調節(jié)因子)的同源基因，但要確定該突變在非達霉素抗性中所起的作用仍需要實驗室研究驗證[56]。

4 利福昔明和四環(huán)素類

CDI的替代療法包括利福霉素類的利福昔明以及四環(huán)素類的替加環(huán)素。利福昔明抑制細菌RNA 聚合酶，并可作為萬古霉素治療rCDI后的序貫治療。細菌RNA聚合酶β亞基RpoB突變是產(chǎn)生利福霉素抗性的主要機制[2]。這些突變會破壞利福霉素和RpoB的直接相互作用或改變RpoB上的利福霉素結合口袋(rifamycin-binding pocket)結構。已發(fā)現(xiàn)CD中存在多處可造成耐藥的RpoB突變，包括Ser488Tyr，Asp492Tyr，His502Asn/Tyr，Arg505Lys，Ser550Phe/Tyr[2]。與其他菌株不同(例如腦膜炎奈瑟球菌和結核分枝桿菌)，RpoB突變導致CD對利福霉素產(chǎn)生耐藥性的同時不會產(chǎn)生體外和體內適應性代價[53]。CD對利福霉素的耐藥性發(fā)展迅速，有研究顯示甚至在利福昔明治療CDI期間就可能出現(xiàn)耐藥，導致臨床治療失敗。在一個病例中，CD菌株(RT056)在利福昔明治療3天內產(chǎn)生了耐藥性，MIC從0.002 mg/L增加到32 mg/L以上[57]。此外，對利福昔明耐藥的C D在醫(yī)療機構內也很常見(耐藥率為29.1%～48.9%)，這可能會增加該藥物治療CDI失敗的風險[58]。由于持續(xù)使用利福霉素較易誘導艱難梭菌產(chǎn)生耐藥突變的特性，目前無論國內還是歐美地區(qū)指南均不推薦該類藥物用作初發(fā)CDI的一、二線治療，僅用于在接近治療終點時短時間內給藥以減少CDI多次復發(fā)的可能[59,60]。

四環(huán)素類是靶向細菌30S核糖體的廣譜抗菌藥物，可阻止氨基酰-tRNA與mRNA結合從而抑制蛋白質翻譯[61]。與利福昔明相比，CD對替加環(huán)素的耐藥率較低。最近的一項Meta分析表明，20%的分離自人類標本的CD菌株對四環(huán)素具耐藥性[62]。CD通過轉座子(例如Tn916、Tn5397和Tn4453)攜帶的各種基因(例如和)編碼的核糖體保護蛋白即延伸因子(elongation-factor)[63]，介導四環(huán)素類藥物耐藥性的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)在歐洲和北美地區(qū)，是CD中最常見的四環(huán)素耐藥決定基因[64]。但由于替加環(huán)素對核糖體的親和力高于傳統(tǒng)四環(huán)素藥物，因此它對攜帶的菌株仍具有活性。對替加環(huán)素的高水平耐藥性由四環(huán)素類破壞酶基因即編碼，它可以通過酶促反應滅活替加環(huán)素[63]。最近發(fā)現(xiàn)的的同源基因出現(xiàn)在家畜和人類標本CD分離株中的可移動元件上，這也提示替加環(huán)素耐藥性可在環(huán)境、社區(qū)與人群間相互傳播[63]。

5 艱難梭菌抗菌新藥的研發(fā)

新型抗菌藥物的研發(fā)是應對耐藥菌感染的重要手段。目前有五種治療CDI的抗菌新藥物已進入臨床研究階段。利地利唑(ridinilazole)是新型的苯并咪唑(bis-benzimidazole)類抗菌藥，作用機制并未未完全闡明，可抑制艱難梭菌二分裂和毒素A、B的產(chǎn)生[65]。II期臨床試驗結果顯示利地利唑有效性非劣效于萬古霉素，且使用利地利唑治療CDI組患者的腸道菌群α多樣性變化更小(<0.0001)，微生物群組成也能更快恢復到治療前的水平[66]。目前該藥正處于III期臨床研究階段。MGB-BP-3是一種基于奎寧- 遠霉素(quinoline–distamycin-based)的人工合成抗菌新藥，作用機制并未完全闡明，可與艱難梭菌DNA小溝結合抑制基因轉錄，對NAP1/027株具強效殺菌作用，體外藥敏MIC為0.25μg/mL[67]。目前該藥正處于II期臨床試驗階段。Ibezapolstat是一種二氯芐基嘌呤衍生物(dichlorobenzyl purine derivative)，為細菌DNA聚合酶III PolC抑制劑，體外藥效學研究顯示其對艱難梭菌的MIC在1～ 8 μg/mL之間[68]。CRS3123是一種苯并吡喃衍生物，作為甲硫氨酰- tRNA合酶抑制劑。臨床前研究顯示CRS3123能夠抑制多種CD臨床分離株的毒素A、B產(chǎn)生，快速緩解CDI癥狀，抑制芽孢形成[69]。該藥物目前已進入II期臨床試驗。DNV3837是一種喹諾酮類與惡唑烷酮雜化后的化合物，體外藥效學研究顯示該藥 MIC為0.25 μg/mL[70]。與上述其他新藥不同，DNV3837為靜脈注射給藥，給藥后血酯酶可使 DNV3837去磷酸化為活性形式 DNV3681，并在腸道組織中富集。因此DNV3837可能為不能耐受口服藥物的CDI患者提供一種替代選擇[71]。該藥物目前亦正處于II期臨床試驗階段。

6 結語與展望

艱難梭菌感染仍然是醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的嚴重威脅和負擔，MDR菌株普遍存在，臨床常用治療藥物如甲硝唑和萬古霉素對CDI的療效下降，替代選擇如利福霉素類藥物更易導致CD耐藥性的快速產(chǎn)生。除傳統(tǒng)機制如藥物轉化、靶位改變、主動外排、生物膜形成等可共同參與耐藥形成外，耐藥質粒亦可介導艱難梭菌的甲硝唑或萬古霉素耐藥。由于艱難梭菌為產(chǎn)芽孢的厭氧革蘭陽性菌，以往用于需氧菌耐藥機制研究的分子生物學技術很多不適用于艱難梭菌耐藥研究，但是近幾年隨著CRISPR-Cas技術的發(fā)展應用，推出了多種基因編輯質粒并可商業(yè)獲得，有助于對艱難梭菌耐藥機制特別是對甲硝唑和萬古霉素等治療用藥物的耐藥機制進行深入研究。隨著對耐藥性變遷和耐藥機制的更好了解，將為抗菌藥物合理應用，遏制耐藥菌的產(chǎn)生和播散、新抗菌藥以及新耐藥菌快速檢測試劑盒的研發(fā)提供理論基礎。

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Progress on mechanisms of antibiotic resistance in

Teng Xu, Haihui Huang

(CD) is one of the most common pathogens causing health-care-associated infectious diarrhea and is listed by the U.S. Centers for Disease Control and Prevention as an urgent antibiotic resistance (AR) threat. Many resistance genes can be transferred between different CD strains present in the clinical setting, community, and environment. The antimicrobial resistance (AMR) of CD continues to evolve with the emergence and acquisition of new drug resistance mechanisms.CD has developed diverse drug resistance mechanisms, such as drug alteration, modification of the target site, and extrusion of drugs via efflux pumps. Researches have provided comprehensive knowledge about resistance mechanisms of macrolides and quinolonesin CD. However, the mechanisms of resistance for metronidazole, vancomycin, and other therapeutic antibiotics againstinfection (CDI) are only beginning to be elucidated. Some previously unfound mechanisms, such as plasmid-mediated drug resistance in CD, may also play an important role. In this review, we summarize the research progress on drug resistance mechanisms of CD with antimicrobial drugs already used clinically, such as metronidazole, vancomycin, and fidaxomicin, thereby providing the references for the clinical treatment and prevention of CDI, as well as the development of new antibacterial drugs and detection kits for drug resistant bacteria.

clostridioides difficile; resistance mechanism; metronidazole; vancomycin; fidaxomicin

2023-08-18;

2023-10-27;

2023-11-03

上海市自然科學基金(編號：21ZR1410800) [Supported by the Natural Science Foundation of Shanghai (No. 21ZR1410800)]

胥騰，博士，住院醫(yī)師，研究方向：細菌耐藥性與耐藥機制研究。E-mail: txu20@fudan.edu.cn

黃海輝，博士，主任醫(yī)師，研究方向：感染性疾病的診治與新藥研發(fā)，厭氧菌耐藥性與耐藥機制研究。E-mail: huanghaihui@fudan. edu.cn

10.16288/j.yczz.23-193

(責任編委: 謝建平)