勾龍飛 何亞元 邱鵬程 黃波

迄今為止，肺癌是最難治療的腫瘤之一[1]。約85%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌[2]，其中肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）占肺癌的40%-51%[3]。LUSC每年導(dǎo)致全球約40萬患者死亡[4]。臨床上，放療和化療仍是LUSC的一線治療策略[5]。近年來，隨著分子研究和藥物研發(fā)的進(jìn)步，LUSC的治療也取得了很大進(jìn)展。然而LUSC的臨床預(yù)后較差，目前尚無有效的靶向治療方案。因此深入探索針對(duì)LUSC治療的新靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是指長度大于200個(gè)核苷酸而不具有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄本[6]。LncRNAs在細(xì)胞發(fā)育和人類疾?。ㄈ绨┌Y）中是至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，能夠通過不同的分子機(jī)制影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)過程，如ceRNAs、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀遺傳調(diào)節(jié)等[7]。研究[8-11]表明lncRNAs在多種腫瘤中具有潛在的致癌或抑癌活性，如肝癌、肺癌和乳腺癌等。已有證據(jù)[12-14]顯示，lncRNA miR143HG作為抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，如lncRNA miR143HG能通過靶向miR-21抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和遷移[15]。此外Wang等[16]提出，lncRNA miR143HG通過特異性吸附miR-504能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。然而lncRNA miR143HG在LUSC細(xì)胞中所扮演的生物學(xué)角色尚不清楚。

微小RNA（microRNAs, miRNAs）已逐漸成為多種癌癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵分子，顯示出調(diào)節(jié)關(guān)鍵致癌途徑的重要能力[17]。作為最保守的多功能miRNAs之一，miR-155表達(dá)的變化與各種生理和病理過程有關(guān)，包括免疫反應(yīng)、炎癥和腫瘤發(fā)生[18]。多項(xiàng)研究[19-21]表明，miR-155的過度表達(dá)是導(dǎo)致多種惡性腫瘤增殖、遷移、侵襲等多種生物學(xué)行為的重要因素之一。盡管miR-155作為一種致癌基因以促進(jìn)LUSC的發(fā)生發(fā)展已被證實(shí)，然而在LUSC的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-155是如何被過度表達(dá)的相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，尤其是受lncRNA miR143HG調(diào)節(jié)的研究相對(duì)較少。此外，相關(guān)研究[22]表明Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié)與惡性腫瘤的進(jìn)展、腫瘤的不良預(yù)后以及癌癥致死率等密切相關(guān)。有研究[23]提出有效調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路可能為各種類型的癌癥提供有希望的治療選擇，包括LUSC的治療。然而，在調(diào)節(jié)lncRNA miR143HG和miR-155基因后，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路是否會(huì)被進(jìn)一步調(diào)節(jié)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此在本研究中，我們基于miR-155基因和Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，重點(diǎn)探討了lncRNA miR143HG對(duì)LUSC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及潛在的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和LUSC細(xì)胞H520均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle’s medium, DMEM）購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；1%青霉素/鏈霉素、RIPA組織裂解液、BCA蛋白定量試劑盒以及CCK-8試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司；過表達(dá)lncRNA miR143HG載體、miR-155mimic及陰性對(duì)照均由廣州銳博生物科技有限公司提供；TRIzol總RNA提取裂解液購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；GoTaq?qPCR Master Mix購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；SYBR Green PCR試劑盒購自上海思新生物化學(xué)技術(shù)有限公司；Wnt抗體、β-Catenin抗體、anti-GAPDH和HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG均購自美國Abcam公司；低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀購自美國ABI公司；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 泛癌及差異分析 在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中獲取與lncRNA miR143HG相關(guān)的多種癌癥患者和健康對(duì)照的樣本數(shù)據(jù)。使用UALCAN網(wǎng)站（http://ualcan.path.uab.edu）進(jìn)行l(wèi)ncRNA miR143HG在TCGA數(shù)據(jù)庫的泛癌分析，以反映不同癌癥和健康組織中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)情況。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中LUSC樣本和健康對(duì)照樣本中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)量差異，利用秩和檢驗(yàn)分析差異顯著性。

1.3 受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線和timeROC曲線 在TCGA數(shù)據(jù)庫（https://tcgadata.nci.nih.gov/tcga/）中獲取與lncRNA miR143HG相關(guān)的502例LUSC患者的樣本數(shù)據(jù)。使用ROC曲線評(píng)估lncRNA miR143HG對(duì)LUSC患者診斷的預(yù)測(cè)效果。利用R包‘pROC’分析和繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（area under the curve, AUC）。使用timeROC評(píng)估m(xù)iR143HG對(duì)LUSC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效果。利用R包‘timeROC’分析和繪制1、3、5和10年的timeROC曲線并計(jì)算出AUC值。

1.4 富集分析 基因集合富集分析（genes set enrichment analysis, GSEA）軟件（版本：4.2.3）用于分析各通路對(duì)lncRNA miR143HG的富集程度。使用lncRNA miR143HG基因表達(dá)量中位數(shù)將LUSC樣本分成兩組（高表達(dá)組和低表達(dá)組），將LUSC基因表達(dá)矩陣輸入GSEA軟件，選取京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）中的通路集進(jìn)行富集分析。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和LUSC細(xì)胞H520均使用DMEM培養(yǎng)液（1%青霉素/鏈霉素+10%胎牛血清）于37oC和5% CO2條件下的恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況每隔2-3 d更換新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞分組與處理 將人LUSC細(xì)胞H520隨機(jī)分為空白對(duì)照組（不做任何處理，blank control，即BC）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染lncRNA-negative control，即lncRNA-NC）、miR143HG組（轉(zhuǎn)染lncRNA miR143HG）和miR143HG+miR-155組（共轉(zhuǎn)染lncRNA miR143HG和miR-155）。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將過表達(dá)lncR NA miR143HG的質(zhì)粒、miR-155mimic及陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)入至H520細(xì)胞中，24 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行下一步功能實(shí)驗(yàn)。

1.7 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將2×103個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，孵育24 h。在每孔內(nèi)均加入CCK-8試劑后避光孵育。2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的吸光度。根據(jù)OD450計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=［（不同時(shí)間點(diǎn)的OD450均值/0 h OD450均值）-1］×100%。

1.8 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 將5×105個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板。培養(yǎng)24 h后，用無菌的200 μ L移液槍頭在中間玻片上劃痕。分別于0和24 h用顯微鏡，在100×的放大倍數(shù)下記錄細(xì)胞的遷移情況。并采用ImageJ對(duì)0和24 h的圖像進(jìn)行分析，分別計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

1.9 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將2×104個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于Transwell上室，向下室中加入含10% FBS的培養(yǎng)基600 μL，置于37oC、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，清洗上室和下室，并在下室中加入400 μL 4%的多聚甲醛，固定10 min。在下室中加入800 μL結(jié)晶紫染液染色10 min后，用清水清洗并晾干，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將2×106個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板。培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞消化后收集到離心管內(nèi)，加入1×Annexin V Binding Solution，制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL上述細(xì)胞懸液，并加入5 μL Annexin V（FITC結(jié)合物），再加入5 μL的PI。在室溫下避光孵育15 min后，再加入400 μL 1× Annexin V Binding Solution，隨后上機(jī)檢測(cè)。

1.11LncRNA miR143HG、miR-155和Wnt/β-Catenin通路相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè) 收集待測(cè)細(xì)胞，使用TR Izol裂解液提取總R NA。利用GoTaq?qPCR Master M i x將總R N A 逆轉(zhuǎn)錄成c D N A。以c DN A為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。以G A PDH和U6 作為內(nèi)參基因。引物序列如下所示：lnc R NA mi R 143HG引物上游：5?-CAGCTCCCAGAACTCGTCCC-3?；lncRNA miR143HG引物下游：5?-CCTCGTCTCCTTTTCCCATGTCT-3?；Wnt引物上游：5?-CATTGAACAGCTGTGAGCCAT-3?；Wnt引物下游：5?-GGAAATACTGATTCCAGGAGG-3?；β-Catenin引物上游：5?-TGGCTGTCTAAGCATAGTGATC-3?；β-Catenin引物下游：5?-GGGCAAGATTTCGAATCAATCC-3?；GAPDH引物上游：5?-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3?；GAPDH引物下游：5?-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3?；miR-155引物上游：5?-CGGCTTAATGCTAATCGTGATAG-3?；miR-155引物下游：5?-GTGCAGGGTCCGAGGT-3?；U6引物上游：5?-CTCGCTTCGGCAGCACA-3?；U6引物下游：5?-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3?。

1.12 Wnt/β-Catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 用RIPA組織裂解液冰上裂解細(xì)胞。12,000 rpm、4oC離心15 min后收集上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒確定總蛋白濃度。每個(gè)樣品取30 μg總蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜電轉(zhuǎn)90 min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用TBST稀釋的5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。隨后，將膜與特異性一抗4oC孵育過夜。隨后用HRP標(biāo)記的二抗（1:10,000）室溫孵育2 h。PBS洗滌后，用ECL顯影液曝光蛋白。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。各一抗稀釋比如下：Wnt（1:1000）、β-Catenin（1:1000）以及GAPDH（1:5000）。

1.13 數(shù)據(jù)分析與處理 使用R語言軟件（版本：4.2.1）實(shí)現(xiàn)‘pROC’和‘timeROC’分析。在泛癌及差異分析中，兩個(gè)獨(dú)立樣本的差異分析采用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用Graph Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泛癌分析 使用UALCAN網(wǎng)站進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA miR143HG的泛癌分析。結(jié)果如圖1，在多種癌組織中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)明顯低于健康組織；而在腎透明細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)明顯高于正常組織。

圖1 LncRNA miR143HG在各種癌癥包括膀胱移行細(xì)胞癌、乳腺浸潤性癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌、結(jié)腸癌、膽管癌、食管癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝臟肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、肉瘤、胃腺癌、甲狀腺癌、胸腺瘤和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況Fig 1 Expression of lncRNA miR143HG in various cancers, including bladder urothelial carcinoma (BLCA), breast invasive carcinoma (BRCA),cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma (CESC), colon adenocarcinoma (COAD), cholangio carcinoma (CHOL),esophageal carcinoma (ESCA), glioblastoma multiforme (GBM), head and neck squamous cell carcinoma (HNSC), kidney chromophobe (KICH),kidney renal clear cell carcinoma (KIRC), kidney renal papillary cell carcinoma (KIRP), liver hepatocellular carcinoma (LIHC), lung adenocarcinoma(LUAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC), pancreatic adenocarcinoma (PAAD), pheochromocytoma and paraganglioma (PCPG), prostate adenocarcinoma (PRAD), rectum adenocarcinoma (READ), sarcoma (SARC), stomach adenocarcinoma (STAD), thyroid carcinoma (THCA), thymoma(THYM), and uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC). NC: negative control; FRKM: fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments.

2.2 差異分析 根據(jù)TCGA中LUSC樣本和健康對(duì)照樣本中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)量，進(jìn)行差異表達(dá)分析。結(jié)果如圖2，與健康對(duì)照樣本比較，LUSC中l(wèi)ncRNA miR143HG表達(dá)較低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖2 LncRNA miR143HG在正常組織和LUSC中的表達(dá)差異（P<0.001）Fig 2 Differential expression of lncRNA miR143HG in normal tissue and LUSC (P<0.001)

2.3 ROC和timeROC曲線 在TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取與lncRNA miR143HG相關(guān)的502例LUSC患者的樣本數(shù)據(jù)如表1所示。使用ROC曲線評(píng)估lncRNA miR143HG對(duì)LUSC患者診斷的預(yù)測(cè)效果。結(jié)果如圖3A所示，得到的ROC曲線的AUC值為0.926，可認(rèn)為其對(duì)于LUSC具有較高的診斷價(jià)值。使用timeROC評(píng)估lncRNA miR143HG對(duì)LUSC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)效果。結(jié)果如圖3B所示，分別分析和繪制1、3、5和10年的timeROC曲線并計(jì)算各自的AUC值，AUC值分別為0.551、0.541、0.546和0.681。由于所得的ROC和timeROC曲線的AUC值均在0.5-1之間，因此lncRNA miR143HG對(duì)于LUSC的診斷和預(yù)后具有較好的預(yù)測(cè)效果。

圖3 LncRNA miR143HG在LUSC中的診斷和預(yù)后的預(yù)測(cè)效果評(píng)估。A：ROC曲線；B：timeROC曲線。Fig 3 The evaluation for the predictive effect on the diagnosis and prognosis of lncRNA miR143HG in LUSC. A: ROC curve; B: timeROC curve. ROC:receiver operating characteristic; AUC: area under the curve.

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中LUSC患者臨床特征統(tǒng)計(jì)Tab 1 Clinical characteristics statistics of LUSC patients in the TCGA database

2.4 富集分析 通過GSEA和KEGG對(duì)lncRNA miR143HG進(jìn)行富集分析。富集在lncRNA miR143HG高表達(dá)組的通路有：黏著斑、血管平滑肌收縮、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞黏附因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）信號(hào)通路（表2、圖4A）；富集在lncRNA miR143HG低表達(dá)組的通路有：氧化磷酸化、細(xì)胞周期、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、檸檬酸循環(huán)、DNA復(fù)制等（表2、圖4B）。然后將TGF-β信號(hào)通路、細(xì)胞黏附因子、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖5所示。

圖4 富集在lncRNA miR143HG的通路。A：lncRNA miR143HG高表達(dá)組；B：lncRNA miR143HG低表達(dá)組。**P<0.01；***P<0.001。Fig 4 Pathways enriched in lncRNA miR143HG. A: lncRNA miR143HG high expression group; B: lncRNA miR143HG low expression group. TGF:transforming growth factor. **P<0.01; ***P<0.001.

圖5 LncRNA miR143HG的部分富集圖。A：TGF-β信號(hào)通路；B：細(xì)胞黏附分子；C：DNA復(fù)制；D：細(xì)胞周期。Fig 5 The part enrichment maps of lncRNA miR143HG. A: TGF-beta signaling pathway; B: Cell adhesion molecules; C: DNA replication; D: Cell cycle.KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.

表2 富集在lncRNA miR143HG高表達(dá)組和低表達(dá)組的通路Tab 2 Pathways enriched in the lncRNA miR143HG high expression group and low expression group

2.5 H520細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞中l(wèi)ncRNA miR143HG和miR-155表達(dá)情況 與人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B比較，lncRNA miR143HG在H520細(xì)胞中低表達(dá)（1.00±0.04vs6.55±0.23,n=3,t=41.18,P<0.001），而miR-155在H520細(xì)胞中高表達(dá)（1.00±0.09vs0.31±0.03,n=3,t=12.60,P<0.001）。另外過表達(dá)lncRNA miR143HG后，與NC組比較，發(fā)現(xiàn)lncRNA miR143HG在miR143HG組細(xì)胞中高表達(dá)（2.96±0.26vs0.83±0.06,n=3,t=13.83,P<0.001），而miR-155在miR143HG組細(xì)胞中低表達(dá)（0.21±0.01vs1.01±0.04,n=3,t=13.83,P<0.001）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG在LUSC細(xì)胞H520中低表達(dá)且負(fù)調(diào)控miR-155表達(dá)。

2.6 各組細(xì)胞增殖能力 如圖6所示，BC組和NC組的細(xì)胞增殖能力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與NC組比較，轉(zhuǎn)染lncR NA miR143HG后，細(xì)胞增殖能力明顯降低（P<0.001）；而過表達(dá)miR NA-155能促進(jìn)lncR NA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞增殖能力（P<0.001）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG能夠抑制H520細(xì)胞的增殖能力，而過表達(dá)miRNA-155能夠逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。

圖6 各組細(xì)胞增殖能力的比較。***P<0.001。Fig 6 Comparison of cell proliferation ability in each group.***P<0.001.

2.7 各組細(xì)胞遷移能力 如表3和圖7所示，BC組和NC組的細(xì)胞遷移能力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與NC組比較，轉(zhuǎn)染lncR NA miR143HG后，細(xì)胞遷移能力明顯降低（P<0.001）；而過表達(dá)miRNA-155能夠促進(jìn)lncRNA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力（P<0.01）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG能夠抑制H520細(xì)胞的遷移，而過表達(dá)miRNA-155能夠促進(jìn)lncRNA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞遷移。

圖7 各組細(xì)胞遷移能力的比較。A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：各組細(xì)胞遷移率。***P<0.001 vs NC組；##P<0.01 vs miR143HG組。Fig 7 Comparison of cell migration ability in each group. A: results of wounding healing assay; B: cell migration rate in each group. ***P<0.001 vs NC group; ##P<0.01 vs miR143HG group.

表3 各組細(xì)胞遷移能力、Wnt蛋白表達(dá)以及β-Catenin蛋白表達(dá)比較（Mean±SD, n= 3）Tab 3 Comparison of cell migration ability and the relative protein expression of Wnt and β-Catenin in each group (Mean±SD, n=3)

2.8 各組細(xì)胞侵襲能力 如圖8所示，與NC組比較，轉(zhuǎn)染lncR NA miR143HG后，細(xì)胞侵襲能力明顯降低（P<0.001）；而過表達(dá)miR NA-155能夠促進(jìn)lncR NA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲能力（P<0.05）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG能夠抑制H520細(xì)胞的侵襲，而過表達(dá)miRNA-155能夠促進(jìn)lncRNA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲。

圖8 各組細(xì)胞侵襲能力的比較。A：結(jié)晶紫染色結(jié)果（×100）；B：各組細(xì)胞侵襲率。***P<0.001 vs NC組；#P<0.05 vs miR143HG組。Fig 8 Comparison of cell invasion ability in each group. A: Results of crystal violet staining (×100); B: Cell invasion rate in each group. ***P<0.001 vs NC group; #P<0.05 vs miR143HG group.

2.9 各組細(xì)胞凋亡率 如圖9所示，與NC組比較，轉(zhuǎn)染lncRNA miR143HG后，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.001）；而過表達(dá)miRNA-155能夠抑制lncRNA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P<0.01）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG能夠促進(jìn)H520細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)miRNA-155能夠抑制lncRNA miR143HG介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖9 各組細(xì)胞凋亡率的比較。A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B：各組細(xì)胞凋亡率。***P<0.001 vs NC組；##P<0.01 vs miR143HG組。Fig 9 Comparison of cell apoptosis rate in each group. A: Detecting results of flow cytometry; B: Cell apoptosis rate in each group. ***P<0.001 vs NC group; ##P<0.01 vs miR143HG group.

2.10 各組細(xì)胞Wnt/β-Catenin通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá) 結(jié)果如表2和圖10所示，BC組和NC組細(xì)胞中Wnt和β-Catenin的基因和蛋白表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與NC組比較，miR143HG組細(xì)胞中Wnt和β-Catenin的基因和蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.001）；與miR143HG組比較，miR143HG+miR-155組細(xì)胞中Wnt和β-Catenin的基因和蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）。以上結(jié)果說明，lncRNA miR143HG能夠激活Wnt/β-Catenin通路，而過表達(dá)miRNA-155能夠抑制lncRNA miR143HG介導(dǎo)Wnt/β-Catenin通路活性。

圖10 各組細(xì)胞Wnt和β-Catenin的基因和蛋白表達(dá)水平比較。A：各組細(xì)胞Wnt/GAPDH基因表達(dá)值比較；B：各組細(xì)胞β-Catenin/GAPDH基因表達(dá)值比較；C：各組Wnt、β-Catenin和GAPDH的蛋白條帶；D：各組細(xì)胞Wnt/GAPDH蛋白表達(dá)值比較；E：各組細(xì)胞β-Catenin/GAPDH蛋白表達(dá)值比較。***P<0.001 vs NC組；##P<0.01，###P<0.001 vs miR143HG組。Fig 10 Comparison of the gene and protein expression levels of Wnt and β-Catenin in each group. A: Comparison of the gene expression values of Wnt/GAPDH in each group; B: Comparison of the gene expression values of β-Catenin/GAPDH in each group; C: Protein blots of Wnt, β-Catenin,and GAPDH in each group; D: Comparison of the protein expression values of Wnt/GAPDH in each group; E: Comparison of the protein expression values of β-Catenin/GAPDH in each group. ***P<0.001 vs NC group; ##P<0.01, ###P<0.001 vs miR143HG group.

3 討論

近年來，lncRNAs受到廣泛的關(guān)注。多項(xiàng)研究[24-27]表明，lncRNAs在多種惡性腫瘤尤其是LUSC的生物學(xué)行為中發(fā)揮了重要作用。LncRNA miR143HG是一種新的lncRNA，其在腫瘤的生物學(xué)行為中的作用研究較少。研究[28]發(fā)現(xiàn)失調(diào)的lncRNA miR143HG與細(xì)胞周期阻滯和凋亡密切相關(guān)。因此我們首次對(duì)lncRNA miR143HG在LUSC中的表達(dá)及其發(fā)揮的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA miR143HG在LUSC中低表達(dá)，表明lncRNA miR143HG可能在LUSC中發(fā)揮著抑癌功能。此外為了進(jìn)一步揭示lncRNA miR143HG在H520細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒來提高H520細(xì)胞中l(wèi)ncRNA miR143HG的表達(dá)。結(jié)果顯示，在H520細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA miR143HG能夠抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA miR143HG能夠明顯下調(diào)miR-155表達(dá)，這表明lncRNA miR143HG能夠負(fù)調(diào)控miR-155表達(dá)。miR-155作為促癌基因，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[29]。因此lncRNA miR143HG或許通過下調(diào)miR-155表達(dá)而發(fā)揮其抑癌功能。本研究通過共轉(zhuǎn)染lncR NA miR143HG和miR-155來證實(shí)兩者的相關(guān)性。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-155能夠逆轉(zhuǎn)lncRNA miR143HG介導(dǎo)的生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖和遷移。

高度保守的Wnt信號(hào)通路是與癌癥密切相關(guān)的細(xì)胞間分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)[30]。值得注意的是，高度保守的Wnt蛋白大小約40 kDa，涉及多種生物學(xué)功能，包括干細(xì)胞控制、胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[31,32]。目前已有Wnt信號(hào)通路和LUSC的相關(guān)研究[33-35]，但Wnt通路與lncRNA miR143HG的相關(guān)性尚未完全確定。因此本研究進(jìn)一步探討lncRNA miR143HG是否影響Wnt信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)lncRNA miR143HG能夠激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的活性，這表明lncRNA miR143HG通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，從而調(diào)控H520細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移能力。

綜上所述，lncRNA miR143HG在LUSC中低表達(dá)且負(fù)調(diào)控miR-155。且lncRNA miR143HG在功能上通過下調(diào)miR-155促進(jìn)H520細(xì)胞的增殖和遷移，其分子機(jī)制可能與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)。

Competing interests

All authors announce that there are no competing interests concerning the publishing of this article.

Author contributions

This manuscript was inspired and supported by Huang B.Gou LF accompanied by He YY conducted all experiments,and Gou LF also wrote this manuscript. Qiu PC accomplished bioinformatics analysis and analyzed all experimental data.All authors read and approved the final manuscript for publication.