蔣智榮,沈鵬程,朱立帆,楊 峰,汪晚怡

(1蘇州市第九人民醫(yī)院骨科,蘇州 215200;2蘇州市第九人民醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科;*通訊作者,E-mail:shenpengchen_1980@163.com)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨的慢性退行性疾病,常伴有關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加,OA的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。迄今為止,OA的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,缺乏有效的策略來減緩、預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)中老年人群的疼痛和殘疾進(jìn)程。因此,研究OA的分子機(jī)制至關(guān)重要。既往研究表明,許多炎癥介質(zhì)參與OA的進(jìn)展,尤其是關(guān)節(jié)內(nèi)白細(xì)胞介素(interleukin,IL-1β)的增加及其受體IL-1R之間的相互作用,在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2]。此外,OA患者軟骨細(xì)胞的退變和凋亡與關(guān)節(jié)破壞相關(guān),在OA的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3,4]。關(guān)于外泌體在OA發(fā)病機(jī)制中的作用已有多項(xiàng)報(bào)道[5,6]。外泌體由多種細(xì)胞、組織和滑膜成纖維細(xì)胞釋放?；こ衫w維細(xì)胞中的外泌體可將微小RNA(microRNA,miRNA)和炎癥蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到組織中,是滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞介導(dǎo)的關(guān)節(jié)局部炎癥的重要調(diào)節(jié)因子。有研究表明,高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)參與了OA患者骨和軟骨的破壞,并在OA的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[7]。在IL-1β處理的OA組織和軟骨細(xì)胞中,HMGB1水平升高。過表達(dá)miR-140-5p通過下調(diào)HMGB1可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥[8]。然而關(guān)節(jié)滑液中的外泌體是否通過分泌HMGB1參與OA的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。在本研究中,我們探討了滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體HMGB1對OA軟骨細(xì)胞進(jìn)展的影響,主要聚集在HMGB1對OA軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

軟骨細(xì)胞系HC-A細(xì)胞購自上海通派生物科技有限公司;PrimeScript RT試劑盒購自上海金畔生物科技有限公司;SYBR Green試劑盒購自上?？￡缮锟萍加邢薰?BCA蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;HMGB1、CD63及CD81一抗抗體均購自英國Abcam公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。紫外分光光度計(jì)購自上海元析儀器有限公司;流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 滑膜成纖維細(xì)胞分離和培養(yǎng) 滑膜組織來源于我院接受治療的骨關(guān)節(jié)患者,患者均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)蘇州市第九人民醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號:SZJY2023058)。將來自骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織分別用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA處理1 h,然后切成0.5～1 mm3的小塊,在室溫條件下用0.2%膠原酶Ⅱ處理4 h。在成纖維細(xì)胞解離后,離心5 min,收集細(xì)胞,將細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在5% CO2的潮濕條件下孵育,將滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至融合率達(dá)到80%,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HMGB1沉默滑膜成纖維細(xì)胞株的構(gòu)建 將滑膜成纖維細(xì)胞按5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種至6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞生長至融合度達(dá)30%時(shí),將HMGB1沉默的慢病毒感染細(xì)胞,感染根據(jù)廠商說明書進(jìn)行處理。在感染48 h后,去除病毒,采用2 μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.2.3 滑膜成纖維細(xì)胞外泌體的分離與鑒定 將獲得的HMGB1沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)滑膜成纖維細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,加入不含外泌體的血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞上清液(cell組)。然后,根據(jù)ExoQuick-TC試劑盒的說明從上清液中提取外泌體(Exo組),在磷酸鹽緩沖液(PBS)中重懸。通過Western blotting檢測外泌體特異性標(biāo)志物CD63及CD81蛋白的表達(dá)。

1.2.4 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng) 將軟骨細(xì)胞系HC-A細(xì)胞以5×104/孔的密度接種到含有10%胎牛血清的DMEM中的24孔板中,并培養(yǎng)24 h,待軟骨細(xì)胞融合至約60%,將軟骨細(xì)胞HC-A分為空白對照組、IL-1β組、IL-1β+Exo組、IL-1β+Exo+NC-siRNA組、IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組?？瞻讓φ战M不作處理;IL-1β組軟骨細(xì)胞使用100 pg/ml IL-1β進(jìn)行干預(yù);IL-1β+Exo組在IL-1β組的基礎(chǔ)上中使用50 μg/ml未進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染的滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體干預(yù);IL-1β+Exo+NC-siRNA組在IL-1β組的基礎(chǔ)上使用轉(zhuǎn)染NC-siRNA的滑膜成纖維細(xì)胞來源外泌體干預(yù);IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組在IL-1β組的基礎(chǔ)上使用轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA的滑膜成纖維細(xì)胞來源外泌體干預(yù)。孵育24 h后,從軟骨細(xì)胞中提取總RNA和蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13、COL2A1 mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol提取軟骨細(xì)胞總RNA。然后使用紫外分光光度計(jì)測定260 nm/280 nm的吸光度比值計(jì)算RNA的濃度和純度。用PrimeScript RT試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后使用SYBR Green試劑盒與real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列見表1。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化對照,使用2-ΔΔCt方法用于評估目的基因的相對表達(dá)量。分別檢測空白對照組、IL-1β組和IL-1β+Exo組IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-13、COL2A1 mRNA,以及IL-1β組、IL-1β+Exo組、IL-1β+Exo+NC-siRNA組和IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組MMP-1、MMP-13、COL2A1 mRNA的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting法檢測外泌體HMGB1、CD63及CD81蛋白的表達(dá) 為鑒定滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體,通過Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測滑膜成纖維細(xì)胞提取物中外泌體標(biāo)志物蛋白HMGB1、CD63及CD81的表達(dá)。使用RIPA裂解緩沖液和磷酸蛋白酶抑制劑裂解外泌體,收集蛋白樣品,之后使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量。然后使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜采用5%的脫脂牛奶阻斷后,在4 ℃下與抗HMGB1、CD63及CD81單克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜。然后在辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗中孵育。用化學(xué)發(fā)光蛋白印跡檢測系統(tǒng)檢測蛋白條帶,將獲得的蛋白條帶采用Image J軟件進(jìn)行定量,分析目的蛋白的表達(dá)。

1.2.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 分別收集IL-1β組、IL-1β+Exo組、IL-1β+Exo+NC-siRNA組和IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組共培養(yǎng)后的HC-A細(xì)胞(5×103/孔)添加至96孔板中,分別在0,24,48,72 h每孔加入10 μl CCK-8溶液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,之后使用微孔板讀數(shù)器評估450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測IL-1β組、IL-1β+Exo組、IL-1β+Exo+NC-siRNA組和IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組軟骨細(xì)胞凋亡情況。將2×105個(gè)/ml細(xì)胞在500g下離心5 min,重新懸浮于195 μl結(jié)合緩沖液中,隨后加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI避光孵育5 min,最后使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。采用Student’st檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)P<0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體中HMGB1蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示,與cell組比較,Exo組外泌體標(biāo)志物CD63、CD81以及HMGB1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,見圖1),提示滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體鑒定成功。

2.2 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體對軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與空白對照組比較,IL-1β組軟骨細(xì)胞增殖能力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05);與IL-1β組比較,IL-1β+Exo組軟骨細(xì)胞增殖能力顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05,見圖2)。

A.CCK-8檢測軟骨細(xì)胞增殖能力B.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

2.3 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體對軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照組比較,IL-1β組軟骨細(xì)胞中IL-6、TNF-α mRNA水平均顯著升高(P<0.05);與IL-1β組比較,IL-1β+Exo組軟骨細(xì)胞中IL-6、TNF-α mRNA水平均顯著降低(P<0.05,見圖3)。

與空白對照組比較,*P<0.05;與IL-1β組比較,#P<0.05

2.4 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體對軟骨降解的影響

實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對照組比較,IL-1β組軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均顯著升高,COL2A1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05);與IL-1β組比較,IL-1β+Exo組軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均顯著降低,COL2A1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05,見圖4)。

與空白對照組比較,*P<0.05;與IL-1β組比較,#P<0.05

2.5 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體HMGB1對軟骨細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與IL-1β+Exo+NC-siRNA組比較,IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組軟骨細(xì)胞中HMGB1蛋白水平顯著降低,細(xì)胞增殖能力顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,IL-6、TNF-α mRNA水平均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與IL-1β組比較,*P<0.05;與IL-1β+Exo+NC-siRNA組比較,#P<0.05

2.6 滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體HMGB1對軟骨降解的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與IL-1β+Exo+NC-siRNA組比較,IL-1β+Exo+HMGB1-siRNA組軟骨細(xì)胞中MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均顯著升高,COL2A1 mRNA表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

與IL-1β組比較,*P<0.05;與IL-1β+Exo+NC-siRNA組比較,#P<0.05

3 討論

OA是老年人最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病,其主要特征是關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞和關(guān)節(jié)炎癥,導(dǎo)致身體殘疾和生活質(zhì)量下降。人們廣泛研究了OA軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白的變化,如基質(zhì)金屬蛋白酶、膠原蛋白和蛋白多糖,結(jié)果顯示,正常人群關(guān)節(jié)軟骨中ECM含量遠(yuǎn)高于OA患者[9,10]。然而,OA的治療結(jié)果和預(yù)后并不令人滿意。例如,最常用的非甾體抗炎和鎮(zhèn)痛藥可能只是通過減輕疼痛和炎癥來改善生活質(zhì)量。而關(guān)節(jié)內(nèi)注射激素或透明質(zhì)酸僅適用于緩解OA炎癥癥狀[11]。因此,對OA發(fā)病機(jī)制的深入研究可能為其治療提供詳細(xì)的理論依據(jù)。

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨的主要結(jié)構(gòu)、功能和代謝單位,其死亡會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解,從而導(dǎo)致軟骨衰竭和關(guān)節(jié)損傷[12]。了解軟骨細(xì)胞退變的潛在機(jī)制可為OA的治療提供新的潛在治療思路。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族在OA的病理過程中發(fā)揮重要作用。MMP-1作為一種膠原酶,是軟骨基質(zhì)降解的限速酶之一,可降解膠原纖維三螺旋區(qū)域的膠原,并誘導(dǎo)其他MMP家族成員的活化,在OA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。MMP-13又稱膠原酶3,是新近發(fā)現(xiàn)的MMP家族成員,在結(jié)締組織中有表達(dá),在骨關(guān)節(jié)炎中升高,參與了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑[14]。研究還發(fā)現(xiàn)多種炎癥調(diào)節(jié)因子在OA組織中異常表達(dá)。從OA患者中分離的軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理后可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),包括前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(nitric oxide,NO)和MMPs的產(chǎn)生[15]。因此,IL-1β已被用于研究OA的分子機(jī)制和制定體外治療策略。本研究結(jié)果與之前的研究一致,IL-1β處理的OA軟骨細(xì)胞在細(xì)胞活力測定中顯示存活率降低,促炎細(xì)胞因子水平升高和MMPs的表達(dá)增加。本研究從滑膜成纖維細(xì)胞中分離外泌體并與IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖能力,抑制細(xì)胞凋亡、炎癥以及軟骨降解,提示滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體可能作為預(yù)防和治療OA的潛在生物標(biāo)志物。Xu等[16]的研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過遞送miR-326靶向HDAC3和STAT1/NF-κ B p65抑制軟骨細(xì)胞焦亡,從而改善OA的進(jìn)展。本研究結(jié)果與這些研究的相同之處在于都表明外泌體可成為調(diào)節(jié)OA發(fā)病機(jī)制的新靶點(diǎn),不同之處在于外泌體的來源細(xì)胞各異,不同細(xì)胞來源的外泌體有不同的特點(diǎn)和功能,可參與調(diào)控多種基本生理過程,如炎癥、細(xì)胞焦亡和免疫反應(yīng)。

目前有關(guān)外泌體作用機(jī)制的研究集中于miRNA,近年來興起的有關(guān)外泌體蛋白組學(xué)的研究結(jié)果顯示,外泌體中能夠通過向臨近細(xì)胞分泌蛋白或與細(xì)胞融合后通過其內(nèi)含的蛋白發(fā)揮效應(yīng)[17]。在炎癥的刺激下,核蛋白HMGB1可移位到細(xì)胞質(zhì)并釋放到胞外。作為晚期炎癥介質(zhì),HMGB1參與了OA患者的長期和持續(xù)性全身性炎癥。與健康人相比,OA患者的軟骨組織和滑液中的HMGB1水平顯著較高,HMGB1的表達(dá)與OA的嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。miR-103a-3p通過下調(diào)HMGB1可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖,減輕細(xì)胞凋亡和炎癥[19]。HMGB1在OA患者中的高表達(dá)以及其增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的功能使HMGB1成為開發(fā)OA治療藥物的理想靶點(diǎn)。近些年研究報(bào)道,腫瘤來源的外泌體HMGB1通過誘導(dǎo)PD1+TAM擴(kuò)增促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展[20]。此外,外泌體HMGB1可通過JNK/HIF-1α信號通路促進(jìn)血管生成[21]。但有關(guān)HMGB1是以何種形式存在于滑膜液中并且如何發(fā)揮效應(yīng)的研究尚未出現(xiàn)。在本研究中,我們將沉默后的HMGB1轉(zhuǎn)染至滑膜成纖維細(xì)胞中,并提取外泌體作用于軟骨細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體可能通過上調(diào)HMGB1的表達(dá)抑制OA的發(fā)生發(fā)展。與此研究類似,Lai等[22]的研究結(jié)果表明,滑膜成纖維細(xì)胞外泌體miR-214-3p可改善軟骨細(xì)胞炎癥和軟骨組織退變。與之不同之處在于,本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體是通過分泌HMGB1參與OA的發(fā)生發(fā)展。此外,本研究也未從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度證明滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體HMGB1對大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥和凋亡作用的影響,所以本實(shí)驗(yàn)還存在一定的局限性。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)了滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體可通過HMGB1介導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)、軟骨降解以及細(xì)胞凋亡。未來可以進(jìn)一步深入研究外泌體在調(diào)控軟骨生物學(xué)中的作用機(jī)制,以更好地理解其潛在的治療應(yīng)用。進(jìn)一步的研究方向可能包括研究不同來源的外泌體在軟骨保護(hù)和修復(fù)中的作用,以及探索HMGB1相關(guān)的潛在藥物干預(yù)方法。這些工作有望為改善軟骨健康和治療軟骨疾病提供新的突破性見解和治療途徑。