陳崢宇,倪安妮,唐玉蓮,孫麗雙,李 書,劉會(huì)婷,羅綠景,李根亮

(右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,百色 533000;*通訊作者,E-mail:ligenliang@ymcn.edu.cn)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌,其預(yù)后差,致死率高,是最常見(jiàn)的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率很高[1-6]。研究發(fā)現(xiàn),部分基因在其發(fā)病和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生了異常變化[7,8]。弄清這些基因異常表達(dá)的原因有利于更好地了解其在肝癌預(yù)防、發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的分子表達(dá)機(jī)制,為HCC的研究提供更多的研究思路。然而,大多數(shù)出現(xiàn)在肝癌組織及其相關(guān)的非病變組織的基因的異常表達(dá)機(jī)制尚不清楚。因此,研究出肝癌組織及其相關(guān)組織中基因的異常表達(dá)機(jī)制具有重要的研究意義,并且可能產(chǎn)生潛在的臨床價(jià)值。

免疫球蛋白μ結(jié)合蛋白2(immunoglobulin mu-binding protein 2,Ighmbp2),該基因編碼是螺旋酶家族的成員,它與免疫球蛋白區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合。該蛋白與DNA復(fù)制、前mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄有關(guān)系,并具有多態(tài)性[9,10]。Ighmbp2是一種依賴ATP的5′端-3′端的螺旋酶,這種螺旋酶主要分布在神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上,并與核糖體相關(guān)。已有研究表明,Ighmbp2引起的氨基酸替代不會(huì)影響核糖體結(jié)合,但會(huì)嚴(yán)重?fù)p害ATPase和螺旋酶的活性[9]。Ighmbp2相關(guān)疾病可導(dǎo)致胃腸道自主功能障礙的嚴(yán)重外周神經(jīng)病變[11]。Ighmbp2可以通過(guò)心臟功能適應(yīng)和物理修飾來(lái)改變DCM的過(guò)程,以應(yīng)對(duì)負(fù)荷和呼吸需求的變化[12]。最近的研究表明,Ighmbp2基因在許多癌癥組織中上調(diào)表達(dá),參與多種惡性瘤體的生長(zhǎng)和發(fā)展而對(duì)預(yù)后產(chǎn)生負(fù)面影響[13-15]。然而,Ighmbp2在肝細(xì)胞癌(HCC)中過(guò)表達(dá)的可能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在本研究中,通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù),分析Ighmbp2基因在HCC中的表達(dá),進(jìn)一步分析全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中各種mRNAs、miRNAs和lncRNAs與Ighmbp2基因的PPI、ceRNA和靶向性等互作關(guān)系,并篩選出Ighmbp2的相關(guān)基因,分析其參與的生物學(xué)功能,探討Ighmbp2基因在HCC組織中上調(diào)表達(dá)的可能調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠H22細(xì)胞系(上海中喬新舟生物科技有限公司)。6～8周雄性昆明小鼠100只(長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證:scxk(湘)2014-0010,scxk(湘)2014-0011),潔凈級(jí),體質(zhì)量25～30 g。

1.2 主要儀器及試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋有限公司,日本),超微量分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司),羅氏LightCycler96 RT-qPCR儀(羅氏企業(yè)有限公司,瑞士)。總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),Thermo Scientific RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司,美國(guó)),SYBR染料qPCR預(yù)混液(廣州易錦生物技術(shù)有限公司),Ighmbp2基因RT-qPCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 HCC小鼠模型的構(gòu)建及樣本的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

首先對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分5組:SL組、H3L組、H30NL組、H30L組、H30T組,每組小鼠20只。其中80只小鼠在前腋下皮下注射H22細(xì)胞后并按期進(jìn)行組織收集,另外20只小鼠在前腋下皮下注射生理鹽水后進(jìn)行組織收集,構(gòu)建方法參照本實(shí)驗(yàn)室之前的方法[16]。20只小鼠注射生理鹽水,收集其肝組織作為SL組。80只小鼠注射H22肝癌細(xì)胞系,收集注射3 d的小鼠的肝組織作為H3L組,收集注射30 d未成瘤小鼠的肝組織作為H30NL組,收集注射30 d成瘤小鼠的癌旁組織作為H30L組,收集注射30 d成瘤小鼠的瘤組織,作為H30T組。H30T組作為實(shí)驗(yàn)組,其他4組作為對(duì)照組。取各樣本組織100 mg并各自進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù),使用RNA提取試劑盒提取總RNA,然后由深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行各樣本的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序。RNA質(zhì)量檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序數(shù)據(jù)的處理按常規(guī)程序進(jìn)行,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析通過(guò)深圳華大基因公司的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)(https://biosys.bgi.com/)完成。RT-qPCR檢測(cè)Ighmbp2基因的表達(dá),內(nèi)參基因?yàn)镚APDH,引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR基因引物設(shè)計(jì)序列

1.4 Ighmbp2基因及其轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)分析

通過(guò)華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)(https://biosys.bgi.com/)收集測(cè)序數(shù)據(jù)中Ighmbp2基因及其轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量,通過(guò)生物信息學(xué)方法分析并獲得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中Ighmbp2蛋白的表達(dá)量數(shù)據(jù),利用Excel轉(zhuǎn)件自帶的分析系統(tǒng)計(jì)算Ighmbp2基因和編碼蛋白在不同組中表達(dá)的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,并利用Origin 8.0繪圖。

1.5 Ighmbp2相關(guān)基因篩選

通過(guò)深圳華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)構(gòu)建Ighmbp2基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)、miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Target)、競(jìng)爭(zhēng)性ceRNA網(wǎng)絡(luò)(ceRNA),收集所有基因(包括mRNA、miRNA和lncRNA),篩選出HCC組織和對(duì)照組織之間的差異表達(dá)基因。差異表達(dá)的閾值為:|log2(FPKM比值)|>1(即二者間FPKM的差異倍數(shù)大于1)、q<0.05(q為校正的P)、各基因表達(dá)的FPKM>10、非編碼RNA的FPKM>1。FPKM指外顯子模型每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的fragments,即每1百萬(wàn)個(gè)比對(duì)上的reads中比對(duì)到外顯子的每千堿基上的reads個(gè)數(shù)。

1.6 Ighmbp2相關(guān)基因的功能分析和互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)分析數(shù)據(jù),構(gòu)建Ighmbp2相關(guān)基因的表達(dá)量聚類熱圖及包含PPI、Target、ceRNA的網(wǎng)絡(luò)互作圖,并對(duì)Ighmbp2相關(guān)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后,采用LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ighmbp2基因在各樣本組織中的表達(dá)

數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,相比SL組,H3L組、H30NL組、H30L組和H30T組中Ighmbp2基因表達(dá)均上調(diào),其中H30T組中表達(dá)最高;組間比較顯示,H30L組與SL組、H30L組與H30NL組、H30L組與H3L組、SL組與H30NL組、SL組與H3L組、H30NL組與H3L組間Ighmbp2基因的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),H30L組與H30T組、H30T組與SL組、H30T組與H30NL組、H30T組與H3L組間Ighmbp2基因的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

另外,在HCC中存在Ighmbp2基因的5個(gè)轉(zhuǎn)錄本:NM_009212.2、XM_006531702.1、XR_001782564.1、XR_001782563.1、XR_388253.2(見(jiàn)圖2)。它們?cè)贖30T組和各對(duì)照組中的表達(dá)量各不相同,除了NM_009212.2、XR_001782564.1、XR_001782563.1的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異外,其他2個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)在H30T組與各對(duì)照組之間的差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q<0.05,見(jiàn)表2),而各對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(q>0.05)。不過(guò),除了Ighmbp2基因的轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1在各樣本中的表達(dá)量都相對(duì)較高外,其他4個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量在各樣本中都相對(duì)較低。也就是說(shuō),Ighmbp2基因在HCC組織中的過(guò)表達(dá)主要是轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1在HCC組織中的過(guò)表達(dá)。

與H30L組相比,*q<0.05;與SL組、H30NL、H3L組比較,#q<0.05

表2 H30T組和對(duì)照組中Ighmbp2基因表達(dá)有差異的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量比較 (n=3)

2.2 Ighmbp2相關(guān)基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析及不同組間樣品間表達(dá)

對(duì)Ighmbp2相關(guān)基因進(jìn)行分析的結(jié)果顯示,存在大量與Ighmbp2具有互作關(guān)系的基因/蛋白,其中與Ighmbp2基因存在密切相關(guān)關(guān)系的基因/蛋白有43個(gè)(見(jiàn)圖3)。

mRNA為Ighmbp2相關(guān)基因的個(gè)數(shù);ppi的深淺為基因與基因之間的關(guān)聯(lián)度

聚類熱圖顯示,這43個(gè)基因的表達(dá)量在不同樣本間及組間的表達(dá)與Ighmbp2基因總體上一致,僅小部分基因的表達(dá)在不同組間具有一定的差異性(見(jiàn)圖4)。

2.3 Ighmbp2相關(guān)基因編碼蛋白的功能

通過(guò)對(duì)Ighmbp2相關(guān)基因編碼蛋白的功能富集分析發(fā)現(xiàn),它主要分布在細(xì)胞核、核質(zhì)、剪接復(fù)合體、外顯子與外顯子連接復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等細(xì)胞組分中,通過(guò)mRNA的加工、RNA剪接、剪接復(fù)合體組裝、凋亡調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程,發(fā)揮蛋白結(jié)合、類泛素化、poly(A)結(jié)合、核酸結(jié)合、核苷酸結(jié)合等功能,參與mRNA監(jiān)測(cè)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA剪接、JAK-STAT信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等途徑(見(jiàn)圖5)。

圖5 Ighmbp2及相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

2.4 Ighmbp2相關(guān)ceRNA及miRNA

Ighmbp2相關(guān)基因的ceRNA、PPI和Target分析結(jié)果表明,Ighmbp2相關(guān)基因不僅與Ighmbp2密切相關(guān),這些基因之間也有著密切的相關(guān)性。在這些相互作用中,既有多個(gè)相關(guān)基因mRNA或(和)lncRNA與Ighmbp2的miRNA互為ceRNA,也有不同Ighmbp2相關(guān)基因編碼蛋白之間的相互作用或miRNA與Ighmbp2基因及其他相關(guān)基因的靶標(biāo)關(guān)系(見(jiàn)圖6)。其中,miR-107-5p、miR-3064-5p和miR-1968-5p在H30T組和各對(duì)照組中的表達(dá)量各不相同,并且它們?cè)贖30T組中的表達(dá)顯著低于其他各組(見(jiàn)表3)。

紅色圓形為Ighmbp2基因;藍(lán)色圖形為Ighmbp2基因的相關(guān)分子;黃色、紅色、橙色線條分別為有關(guān)聯(lián)的ceRNA、具有互作關(guān)系的分子及具有靶向關(guān)系的分子

表3 H30T組和對(duì)照組Ighmbp2基因相關(guān)miRNAs的表達(dá)

3 討論

Ighmbp2是一種能與核糖體和多聚體結(jié)合的細(xì)胞溶性蛋白質(zhì),與DNA復(fù)制、前mRNA剪接和轉(zhuǎn)錄有關(guān),在mRNA代謝中起作用[17,18]。研究表明,該分子廣泛分布于子宮內(nèi)膜、皮膚、骨髓、肌肉等多種組織和器官中[19,20]。研究結(jié)果表明,Ighmbp2基因在HCC組織中過(guò)表達(dá)而在對(duì)照組織中低表達(dá),它的表達(dá)量與各階段對(duì)照組織的表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。但是,在注射H22肝癌細(xì)胞3 d和30 d均未成瘤小鼠的肝組織中表達(dá)差異并不明顯,且注射30 d成瘤小鼠的肝組織比注射3 d和30 d未成瘤小鼠中的表達(dá)量還要低,這可能與機(jī)體對(duì)腫瘤異物的免疫有關(guān)。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后,腫瘤微環(huán)境分泌大量細(xì)胞因子等相互作用,引起肝臟組織中Ighmbp2高表達(dá);當(dāng)腫瘤細(xì)胞戰(zhàn)勝機(jī)體免疫快速生長(zhǎng),肝細(xì)胞受到極大的損傷,成瘤小鼠癌旁肝臟組織中Ighmbp2表達(dá)量減低,腫瘤組織分泌Ighmbp2增多。另外,腫瘤的發(fā)展不僅受限于細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡,還受限于腫瘤抑制基因和凋亡信號(hào)致癌之間的平衡。Merino等[21]就曾報(bào)道凋亡細(xì)胞死亡的缺陷可以促進(jìn)癌癥的發(fā)生,并損害惡性細(xì)胞對(duì)抗癌治療的反應(yīng)。BMAL1和CLOCK通過(guò)控制Wee1和p21水平促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖,從而防止細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯[22]。當(dāng)然,這其中不排除Ighmbp2相關(guān)基因在其中起著重要作用。

Ighmbp2基因在各樣本中都存在5個(gè)轉(zhuǎn)錄本,且這些轉(zhuǎn)錄本在各樣本的表達(dá)變化趨勢(shì)大致相同,且在瘤體組織中的表達(dá)都高于各對(duì)照組織,其中只有轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1和XR_388253.2的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,尤其轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1在HCC組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)超其他轉(zhuǎn)錄本。這說(shuō)明該基因在HCC中的作用可能主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1起作用,而其他的轉(zhuǎn)錄本可能只是從旁協(xié)助。

通過(guò)深圳華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)分析,獲得了大量與Ighmbp2具有互作關(guān)系的基因,表明該基因功能的復(fù)雜性和作用機(jī)制的多樣性。雖然Ighmbp2相關(guān)基因種類眾多,但僅有143種差異表達(dá)于HCC組織和對(duì)照組織之間。Ighmbp2相關(guān)基因既有mRNA,也有miRNA和lncRNA,其中miR-107-5p、miR-3064-5p和miR-1968-5p這3種miRNA高表達(dá)于對(duì)照組織而低表達(dá)于HCC瘤體組織,而Ighmbp2恰恰相反,其高表達(dá)于瘤體組織而低表達(dá)于對(duì)照組織。由此推測(cè),這3種miRNA可能在對(duì)照組織中過(guò)表達(dá)從而抑制Ighmbp2的表達(dá),而在瘤體組織中低表達(dá)導(dǎo)致抑制效應(yīng)的減弱進(jìn)而促使Ighmbp2在瘤體組織中上調(diào)表達(dá),其中miR-1968-5p在HCC瘤體組織與對(duì)照組織中的差異表達(dá)也遠(yuǎn)高于其他2種miRNA,說(shuō)明作為其靶標(biāo)分子的Ighmbp2基因的表達(dá)受到miR-1968-5p的影響可能遠(yuǎn)大于受到其他2種miRNA的影響。而各種lncRNA及多種相關(guān)基因的mRNA可能通過(guò)與Ighmbp2基因的mRNA互為ceRNA而進(jìn)一步精細(xì)調(diào)控Ighmbp2基因的表達(dá)。如造血干細(xì)胞釋放的CXCL1通過(guò)MIR4435-2HG/miR-506-3p/TGFB1軸加重了HCC細(xì)胞的惡性行為[23]。Circ_0007429通過(guò)miR/TRIM71/Ago2軸促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和有氧糖酵解,抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展[24]。

Ighmbp2基因功能很多,但主要集中在核功能方面,如RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)(GO:0006357)、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)(GO:0000122)、蛋白質(zhì)同源寡聚化(GO:0051260)等生物學(xué)過(guò)程。在翻譯和mRNA代謝等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用[25],其突變會(huì)導(dǎo)致α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的缺失,進(jìn)而導(dǎo)致肌肉萎縮,尤其是遠(yuǎn)端肌肉的萎縮[26]。這與該基因所編碼的蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞部位及其所具有的分子功能相關(guān)。Ighmbp2基因編碼蛋白存在部位包括細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(GO:0048471)、細(xì)胞質(zhì)(GO:0005737)、核糖核蛋白復(fù)合體(GO:1990904)、核(GO:0005634)等。其分子功能包括螺旋酶活性(GO:0004386)、ATP結(jié)合(GO:0005524)、5′-3′ DNA解旋酶活性(GO:0043139)、核糖體結(jié)合(GO:0043022)、富含G的單鏈DNA結(jié)合(GO:1990955)、RNA結(jié)合(GO:0003723)、核苷酸結(jié)合(GO:0000166)等。

Ighmbp2及其相關(guān)基因的功能富集結(jié)果還表明,該基因與其相關(guān)基因通過(guò)互為ceRNA、PPI或作為靶標(biāo),可能主要通過(guò)解旋酶活性、核苷酸結(jié)合、ATP結(jié)合和ATP依賴性5′-3′ DNA解旋酶活性等分子功能,在核、核仁、核糖核蛋白復(fù)合物和突觸后細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞部位,參與細(xì)胞大小的負(fù)調(diào)節(jié)、端粒維持的負(fù)調(diào)控、中性粒細(xì)胞凋亡的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程,如ABT1與Ighmbp2的結(jié)合提高了ATPase和螺旋酶的活性以及Ighmbp2的處理能力[25]。實(shí)現(xiàn)Ighmbp2基因?qū)CC發(fā)生、發(fā)展和遷移的促進(jìn)作用。

綜上所述,Ighmbp2基因在H30T組中的表達(dá)高于其他對(duì)照組可能主要通過(guò)以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn):一是Ighmbp2基因在HCC組織以轉(zhuǎn)錄本XM_006531702.1的過(guò)表達(dá)為主,轉(zhuǎn)錄本XR_388253.2過(guò)表達(dá)為輔,進(jìn)而參與HCC的病理過(guò)程;二是原來(lái)在對(duì)照組織中高表達(dá)而在HCC瘤體組織中低表達(dá)的3種miRNA,尤其miR-1968-5p,與lncRNA和mRNA等分子形成ceRNA調(diào)控機(jī)制在HCC瘤體組織中異常表達(dá),從而抑制了HCC中miR-1968-5p及其他2種miRNA的表達(dá),進(jìn)而間接促進(jìn)了Ighmbp2基因的表達(dá);三是Ighmbp2與其相關(guān)基因的異常表達(dá)從而使細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞組分出現(xiàn)異常,進(jìn)而通過(guò)影響對(duì)細(xì)胞大小的負(fù)調(diào)控,對(duì)端粒維持的負(fù)調(diào)控,對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程而促進(jìn)HCC的病理過(guò)程。另外,Ighmbp2相關(guān)基因還可能在肝癌、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡,甚至mTOR和趨化因子等信號(hào)通路中相互協(xié)同,共同調(diào)控機(jī)體的HCC的病理過(guò)程,但分析結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)Ighmbp2基因參與這些KEGG通路,表明這些功能雖然也可能參與HCC的病理過(guò)程,但可能與Ighmbp2基因過(guò)表達(dá)及參與調(diào)控HCC的作用機(jī)制不同。