秦李楊,刁玉剛,韓曉航

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科,沈陽 110011;*通訊作者,E-mail:medicine0426@163.com)

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,在我國發(fā)病率和死亡率較高,患者通常在晚期才被診斷,治療選擇少,手術(shù)及化療等常規(guī)治療效果不好,預(yù)后差[1]。開發(fā)新的藥物治療尤為迫切。肝癌跟炎癥密切相關(guān),肝癌通常由慢性肝病發(fā)展而成,而持續(xù)性炎癥會促進和加劇肝癌發(fā)展[2]。因此,從炎癥方向?qū)ふ铱垢伟┧幬镉兄匾饬x。脂多糖(LPS)被報道在體外能夠誘導(dǎo)細胞炎癥性反應(yīng),被Toll樣受體4識別并激活絲裂原活化蛋白激酶,從而誘導(dǎo)促炎細胞因子基因表達[3],其中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肝損傷的形成和發(fā)展過程中起重要作用[4]。丙泊酚是一種短效靜脈麻醉藥,被報道可抑制卵巢癌細胞侵襲、遷移及血管生成[5],抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系的增殖、促進凋亡[6],說明丙泊酚有抗腫瘤功能;丙泊酚聯(lián)合七氟醚能夠明顯改善血清炎癥因子表達,保護肝炎患者肝腎功能[7],證明了其抗炎作用,但其抗炎及抗癌的作用機制尚不完全明確。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路是一種對炎癥反應(yīng)至關(guān)重要的通路,NF-κB是將慢性炎癥與癌癥聯(lián)系起來的最重要分子之一,NF-κB激活誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄,如促增殖和抗凋亡基因,參與多種腫瘤增殖、凋亡及遷移等行為[8]。但丙泊酚是否可以通過調(diào)控NF-κB信號通路影響LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞的惡性行為尚未可知。因此,本研究探討丙泊酚干預(yù)對LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞增殖、凋亡、遷移及炎癥因子的影響以及對NF-κB信號通路的調(diào)控機制,可為肝癌的治療提供新研究方向,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌細胞MHCC97H購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 丙泊酚(批號:N18GB168406,純度≥98%)、LPS(批號:J07HS174755,純度≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司;NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082(批號:J07HS173399,純度≥99%)購自上海源葉生物科技有限公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(批號:Feb-22)購自睿信生物科技有限公司,活細胞計數(shù)(CCK-8)試劑盒(批號:C6205060)購自上海翌圣生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒(批號:042621211123)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Hoechst 33258染色試劑盒(批號:20220304)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,鼠抗人IKKα、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、細胞周期素D1(Cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(二抗)均購自美國CST公司。

1.1.3 儀器 MF52-N型倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司);Multiskan Ascent型酶標儀(美國Thermo公司);H4-20kr型低溫高速離心機(湖南可成儀器設(shè)備有限公司);DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人肝癌MHCC97H細胞培養(yǎng) 在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將人肝癌MHCC97H細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%青-鏈霉素)中,待細胞培養(yǎng)貼壁達80%以上時進行細胞傳代,取第4代對數(shù)期生長MHCC97H細胞用于實驗。

1.2.2 分組及給藥 選取第4代對數(shù)期生長的肝癌MHCC97H細胞,調(diào)整密度至2×105個/ml,接種到96孔板中,每孔100 μl。將肝癌MHCC97H細胞分為對照組、LPS組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和中劑量+BAY 11-7082組,對照組細胞不做干預(yù),LPS組加入1 μg/ml LPS,低劑量組、中劑量組、高劑量組以1 μg/ml LPS分別與12.5,25,50 μmol/L丙泊酚同時給藥共培養(yǎng),中劑量+BAY 11-7082組1 μg/ml LPS與25 μmol/L丙泊酚和10 μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082同時給藥共培養(yǎng),每組設(shè)置3個復(fù)孔,后置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 ELISA試劑盒檢測MHCC97H細胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α表達水平 收集各組干預(yù)24 h后的細胞上清液,按照TNF-α ELISA試劑盒說明書操作步驟,根據(jù)標準曲線計算炎癥因子TNF-α表達水平。

1.2.4 CCK-8法測定MHCC97H細胞的活力 選取第4代對數(shù)期生長的細胞,調(diào)整密度至2×105個/ml,接種到96孔板中,每孔加100 μl,實驗重復(fù)3次。各組干預(yù)24 h后,加入CCK-8溶液10 μl,繼續(xù)孵育2 h,使用酶標儀測定各組OD值(450 nm)。細胞活力(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.5 EdU法測定MHCC97H細胞的增殖率 取各組干預(yù)24 h的細胞,進行EdU處理,去除培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛0.5 ml,固定,洗滌,去除BSA后再洗滌3次;加200 μl Click反應(yīng)液(現(xiàn)配現(xiàn)用),室溫避光孵育30 min,洗滌后去除Click反應(yīng)液;加入Hoechst孵育10 min;洗滌后裝片,拍照,再用ImageJ軟件處理圖片。EdU陽性染色細胞(紅色)占總細胞(藍色)的百分比表示細胞增殖率。

1.2.6 Hoechst 33258染色法測定MHCC97H細胞凋亡率 干預(yù)24 h的細胞,洗滌后加入多聚甲醛固定并洗滌,染色后洗滌,封固后熒光顯微鏡觀察拍照。凋亡細胞的形態(tài)特征是細胞核染色不均濃染且所發(fā)熒光較強,呈亮藍色。Image-J圖像分析軟件計算凋亡細胞數(shù)。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Transwell小室法測定MHCC97H細胞的遷移能力 將Transwell小室放入24孔板中,在Transwell小室的上室中加細胞懸液(1×106/ml),下室加入600 μl含有10% FBS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄上清,棉簽擦去小室薄膜上層細胞清洗后固定。晾干后染色并清洗。在顯微鏡下觀察拍照。Image-J圖像分析軟件計算遷移細胞數(shù)。

1.2.8 蛋白免疫印跡法檢測MHCC97H細胞中Cyclin D1、Caspase-3和NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達水平 干預(yù)24 h時,收集各組細胞于RIPA液在冰上進行裂解,4 ℃,12 000 r/min離心20 min,取上清進行蛋白變性后,制膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,并封閉2 h,然后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗[IKKα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、Cyclin D1(1∶5 000)、Caspase-3(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000)],4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000),孵育2 h,棄去液體并洗滌,最后加顯影液,拍照記錄。蛋白相對表達量用目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞的炎癥

人肝癌MHCC97H細胞的炎癥水平用炎癥因子TNF-α的表達水平進行評估。ELISA結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組細胞炎癥因子TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,丙泊酚中、高劑量組細胞炎癥因子TNF-α表達水平降低(P<0.05),而低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),丙泊酚中、高劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與對照組相比,*P<0.05;與LPS組相比,#P<0.05

2.2 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞的活力

CCK-8實驗結(jié)果顯示,干預(yù)24 h時,與對照組比較,LPS組細胞活力顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,丙泊酚中、高劑量組細胞活力降低(P<0.05),而低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),丙泊酚中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。為避免細胞死亡過多對實驗的影響,我們選擇對細胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義的較低濃度中劑量組加入NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082進行NF-κB通路驗證實驗。

與對照組相比,*P<0.05;與LPS組相比,#P<0.05

2.3 丙泊酚通過抑制NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞的增殖

EdU結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組細胞增殖率顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組細胞增殖率顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組細胞增殖率顯著降低(P<0.05,見圖3)。

2.4 丙泊酚通過抑制NF-κB通路促進LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞的凋亡

Hoechst 33258實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見圖4)。

圖4 Hoechst染色檢測丙泊酚對LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞凋亡的影響 (×20)

2.5 丙泊酚通過抑制NF-κB通路抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞的遷移

Transwell實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組遷移細胞數(shù)顯著增加(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組遷移細胞數(shù)顯著減少(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組遷移細胞數(shù)顯著減少(P<0.05,見圖5)。

2.6 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞Cyclin D1蛋白表達并促進Caspase-3蛋白表達

Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組Cyclin D1蛋白表達水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05);與LPS組相比,中劑量組Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低,而Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低,而Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05,見圖6)。

2.7 丙泊酚抑制LPS誘導(dǎo)MHCC97H細胞NF-κB通路的活化

Western blot實驗結(jié)果顯示,各組之間IκBα和NF-κB p65蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組相比,LPS組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,中劑量組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,中劑量+BAY 11-7082組IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平進一步顯著降低(P<0.05,見圖7)。

3 討論

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高,往往診斷時已處于肝癌晚期,導(dǎo)致其預(yù)后不良,手術(shù)和放化療是最佳選擇,但治療后病情易反復(fù)甚至加劇,影響患者生活質(zhì)量[9],開發(fā)新的治療方法是必要的。炎癥已被認為是癌癥的標志,并且已知在大多數(shù)癌癥的發(fā)展和進展中發(fā)揮重要作用,肝炎通過分泌各種生長因子和細胞因子促進肝癌細胞的增殖和遷移,參與腫瘤進展[10,11]。丙泊酚是一種常用的鎮(zhèn)靜藥物,在癌癥手術(shù)用于全身麻醉,近來發(fā)現(xiàn)丙泊酚在各種癌癥發(fā)揮抗腫瘤作用[12],但丙泊酚對LPS誘導(dǎo)肝癌細胞的抗腫瘤機制未見報道。所以本實驗研究丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的肝癌炎性作用、增殖、凋亡及遷移等惡性行為及對NF-κB信號傳導(dǎo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)后細胞炎癥因子TNF-α表達水平和細胞活力顯著升高,提示LPS可以誘導(dǎo)MHCC97H細胞的炎癥發(fā)生,促進細胞的活力。加入丙泊酚處理后,中劑量組和高劑量組TNF-α表達水平和細胞活力顯著低于LPS組,說明25 μmol/L和50 μmol/L丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞炎癥和細胞活力,其中高劑量組細胞活力較低,為避免細胞死亡過多對實驗的影響,我們選擇對細胞活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義且濃度較低的中劑量組進行后續(xù)的實驗,結(jié)果表明,LPS組細胞增殖率和遷移數(shù)顯著高于對照組,細胞凋亡率顯著低于對照組,說明LPS促進MHCC97H細胞的增殖和遷移,抑制其凋亡,加入25 μmol/L丙泊酚處理后,顯著扭轉(zhuǎn)了這些指標的變化,證明了丙泊酚可以抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞增殖和遷移能力,促進其凋亡能力,與丙泊酚抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲這一報道結(jié)果相符[13]。細胞的增殖與凋亡是細胞功能中較為重要的兩個指標,Cyclin D1作為細胞增殖標志物,其高表達可促進細胞增殖,調(diào)節(jié)從G1期到S期的轉(zhuǎn)變[14]。細胞凋亡是一種多種因素誘導(dǎo)程序性細胞死亡的生物學(xué)過程,Caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵因子,在細胞凋亡中起重要作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,LPS誘導(dǎo)促進Cyclin D1蛋白表達,抑制Caspase-3蛋白表達,加入25 μmol/L丙泊酚處理后,顯著扭轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)Cyclin D1和Caspase-3的表達,提示丙泊酚可能是通過下調(diào)Cyclin D1和上調(diào)Caspase-3來抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。

NF-κB通路是炎癥和癌癥之間聯(lián)系的重要通路,NF-κB激活主要發(fā)生在癌細胞中,受到多種機制的嚴格調(diào)控,由細菌內(nèi)毒素(LPS等)和腫瘤壞死因子(如TNF-α)等促炎細胞因子啟動,激活后誘導(dǎo)多種靶基因,串?dāng)_許多信號通路,參與調(diào)控多種癌細胞生長和分化[16]。NF-κB信號通路被報道在肝炎與肝癌的發(fā)展中均有重要調(diào)節(jié)作用,且與細胞的增殖、凋亡相關(guān)[17,18]。有研究表明,丙泊酚可以促進心肌細胞NF-κB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19],丙泊酚通過抑制NF-κB活化抑制LPS誘導(dǎo)的羊膜細胞炎癥[20]。但關(guān)于丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的肝癌細胞中NF-κB信號通路的調(diào)控作用未見報道,因此本研究分析了丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細胞中NF-κB通路蛋白的表達水平,結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)后細胞IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達顯著升高;而加入25 μmol/L丙泊酚處理后,IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達顯著降低,提示了丙泊酚可能抑制了NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在中劑量組中加入NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082進行NF-κB通路驗證實驗,發(fā)現(xiàn)與中劑量組相比,加入抑制劑后,中劑量+BAY 11-7082組細胞增殖率、遷移數(shù)及Cyclin D1、IKKα、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達顯著降低,細胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達顯著升高,提示丙泊酚可能是通過抑制NF-κB信號通路以及上調(diào)Caspase-3和下調(diào)Cyclin D1來抑制細胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)其凋亡的。

綜上所述,丙泊酚可能通過抑制NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的人肝癌MHCC97H細胞增殖和遷移,降低炎癥,誘導(dǎo)凋亡。本實驗證明丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的肝癌細胞的炎性作用及惡性行為,對治療肝癌有重要意義,但本文僅在體外實驗進行研究,還需進一步在動物模型上分析丙泊酚的抗癌作用,為肝癌的治療提供更為全面的理論支持。