劉浩，張辛蕓，楊宇萍，范瀟曉，王文琪，梁敬臣，劉永剛*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

2.北京三和麗生物科技有限公司，北京 100068

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚病，患病率為全球人口的0.5%～2%，臨床表現(xiàn)為頭面部、頸部、手、足等部位出現(xiàn)白斑[1-3]。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白癜風(fēng)屬于“白駁風(fēng)”“斑駁”“白癜”等范疇，風(fēng)邪相搏、氣血失和、脈絡(luò)瘀阻為此病的病因病機(jī)[4-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制主要集中在自身免疫學(xué)說、黑色素細(xì)胞凋亡學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳與環(huán)境因素學(xué)說等方面[4,6-8]。

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，具有補(bǔ)中益氣、緩急止痛、清熱解毒、化痰止咳、調(diào)和藥性等諸多功效[9]。甘草中主要含有三萜類、黃酮類等多種化學(xué)成分，其中，甘草酸苷作為甘草中的重要活性成分，具有活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞），促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞分化，誘導(dǎo)γ-干擾素產(chǎn)生，從而直接減少黑素細(xì)胞的損傷，恢復(fù)黑素細(xì)胞的功能[10]。因此，臨床上常使用復(fù)方甘草酸苷片對(duì)白癜風(fēng)進(jìn)行治療[11-12]。

為了分析甘草治療白癜風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法[13]，系統(tǒng)分析甘草治療白癜風(fēng)的主要活性成分、核心靶點(diǎn)以及通路，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 甘草中活性成分及其作用靶點(diǎn)的獲得

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php/），設(shè)置篩選條件為化合物的口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18[14]，檢索得到甘草中的活性成分。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分的“Canonical SMILES”，將其輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swiss targetprediction.ch/）預(yù)測(cè)得到各個(gè)活性成分的靶點(diǎn)蛋白名稱，即為甘草中活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 白癜風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的獲得

使用OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org）和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），以“vitiligo”為關(guān)鍵詞檢索獲取白癜風(fēng)的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 甘草-白癜風(fēng)Venn 圖的制作

將甘草中活性成分的靶點(diǎn)和白癜風(fēng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入微生信數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://www.bioinfor matics.com.cn）得到甘草-白癜風(fēng)的交集靶點(diǎn)，并制作Venn 圖。

1.4 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將甘草中的活性成分及其作用靶點(diǎn)與白癜風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的交集導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用Cyto NCA 插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，以“中介中心性（betweenness）、親密性（closeness）、特征向量（eigenvector）大于中位數(shù)”為篩選條件[15]，獲取得到甘草治療白癜風(fēng)的主要活性成分。將甘草主要活性成分及其作用靶點(diǎn)與白癜風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)的交集導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建得到“甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的獲取

將甘草-白癜風(fēng)的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），以物種限定為Homo sapien、高置信度 0.700 為篩選條件，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，利用Cyto NCA 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，根據(jù)degree 值大小，篩選得到甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)。

1.6 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)的富集分析

以“Homo sapiens”為條件，使用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org）對(duì)甘草-白癜風(fēng)的交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。將分析結(jié)果導(dǎo)入微生信數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https://www.bio informatics.com.cn），制作GO 功能富集分析柱形圖和KEGG 通路富集分析氣泡圖。

1.7 活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接

使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找甘草主要活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，為小分子配體。以“Homo sapiens”和“X-RAY DIFFRACTION”為篩選條件，使用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）查找核心靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，為蛋白受體。使用PyMol 3.7.3 軟件對(duì)蛋白受體進(jìn)行去除水分子、添加氫原子等操作，使用AutoDockTools 1.5.7 將二者進(jìn)行分子對(duì)接，通過PyMol 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 甘草中的活性成分及其作用靶點(diǎn)

篩選得到符合條件的化學(xué)成分92 種，其中，7-甲氧基-2-甲基異黃酮、鱗葉甘草素B、8-(6-羥基-2-苯并呋喃基)-2,2-二甲基-5-色烯醇等8 種化學(xué)成分沒有對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，剩余84 種化學(xué)成分為甘草中的活性成分見表1。并檢索得到84 種活性成分的作用靶點(diǎn)共8 400 個(gè)。

表1 甘草活性成分Table 1 Active ingredients of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

2.2 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)Venn 圖

通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得白癜風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)1 349 個(gè)。使用微生信數(shù)據(jù)分析平臺(tái)對(duì)白癜風(fēng)相關(guān)靶點(diǎn)與甘草活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到甘草-白癜風(fēng)的交集靶點(diǎn)133 個(gè)，見圖1。

圖1 甘草-白癜風(fēng)Venn 圖Fig.1 Venn diagram of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and vitiligo

2.3 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，經(jīng)過中位數(shù)篩選后，選取谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素6 個(gè)化學(xué)成分作為甘草中的主要活性成分，見表2。將甘草中6 個(gè)主要活性成分及133 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建得到“甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。共得到135個(gè)節(jié)點(diǎn)，398 條邊（節(jié)點(diǎn)表示藥物、活性成分和作用靶點(diǎn)，邊表示3 者之間的相互作用）。

圖2 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma active ingredient-vitiligo target network diagram

表2 甘草治療白癜風(fēng)主要活性成分Table 2 Main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo

2.4 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)

將甘草-白癜風(fēng)的133 個(gè)交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.9.1 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖，見圖3，共133 個(gè)節(jié)點(diǎn)，464 條邊。根據(jù)degree 值，篩選得到蛋白激酶B1（Akt1）、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、有絲分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）6 個(gè)靶點(diǎn)作為甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)，見表3。靶點(diǎn)的degree 值越大，顏色越深，表明其可能是甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)。

圖3 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Target PPI network of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma-vitiligo intersection

表3 甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)Table 3 Core target of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo

2.5 甘草-白癜風(fēng)交集靶點(diǎn)的富集分析

GO 功能富集分析中，生物過程（BP）共1 601條，主要包括細(xì)胞對(duì)肽激素的反應(yīng)（cellular response to peptide hormon）、對(duì)肽激素的反應(yīng)（response topeptide hormone）、細(xì)胞對(duì)肽的反應(yīng)（cellular response to peptide）、對(duì)肽的反應(yīng)（response to peptide）、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)（cellular response to nitrogen compound）等；細(xì)胞組分（CC）共60 條，主要包括血小板α 顆粒管腔（platelet alpha granule lumen）、血小板α 顆粒（platelet alpha granule）、分泌顆粒管腔（secretory granule lumen）、胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）等；分子功能（MF）共138 條，主要包括蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、蛋白質(zhì)絲氨酸激酶活性（protein serine kinase activity）等。通過微生信數(shù)據(jù)分析平臺(tái)制作得到GO 功能富集分析柱形圖，見圖4。

圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，甘草治療白癜風(fēng)的通路共183 條。將排名前20 位的KEGG 通路富集分析結(jié)果輸入微生信數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，制作得到KEGG 通路富集分析氣泡圖，見圖5。由圖5 可知，甘草治療白癜風(fēng)的靶點(diǎn)主要涉及的信號(hào)通路有糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、C-型凝集素受體信號(hào)通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、人T 細(xì)胞白血病病毒1 型感染（human T-cell leukemia virus 1 infection）、人巨細(xì)胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、癌癥通路（pathways in cancer）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）、乙型肝炎（hepatitis B）、細(xì)胞衰老（cellular senescence）等。

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

甘草的主要活性成分為谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查爾酮B、刺芒柄花黃素。使用軟件AutoDockTools 1.5.7 將其分別與核心靶點(diǎn)VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接的結(jié)合能越小，表明小分子配體和蛋白受體之間互作的可能性越大。由表4可知，谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素 6 個(gè)主要活性成分與核心靶點(diǎn)VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 顯示出較好的結(jié)合，其結(jié)合能較低表示出其具有一定的結(jié)合力，使用PyMol 軟件進(jìn)行處理，得到可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 核心靶點(diǎn)與甘草主要活性成分的分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking of core targets with the main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

表4 分子對(duì)接結(jié)果Table 4 Molecular docking results

3 討論

研究表明，甘草中的主要活性成分甘草酸可提高酪氨酸酶活性，促進(jìn)黑色素合成，以此發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用[16-17]。以甘草酸苷為主要成分的復(fù)方甘草酸苷片具有活化T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞，促進(jìn)胸腺外T 淋巴細(xì)胞分化和黑色素生成的功能，因其治療效果較好，無明顯毒副作用成為臨床治療白癜風(fēng)的主要制劑[18-19]。為了進(jìn)一步探索甘草治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法篩選得到甘草中的活性成分84 種，其中治療白癜風(fēng)的主要活性成分為谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素。

PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 可能為甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)。Akt1 作為AKT 的異構(gòu)體之一，主要參與細(xì)胞凋亡過程[20]；STAT3[21]、TNF[22]、MAPK1[14]主要與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)；IL-6 為一種26-kD 分泌蛋白，具有刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23-24]；VEGFA 是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，經(jīng)典的VEGF 信號(hào)通過VEGFR1/R2 調(diào)節(jié)幾種激酶的活性，最終在血管生成和血管生成過程中指導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、存活和血管通透性[25]。綜上所述，甘草治療白癜風(fēng)的6 個(gè)核心靶點(diǎn)主要與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫過程等密切相關(guān)。由此可推測(cè)，甘草中的谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、甘草查耳酮B 等通過作用于Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 等靶蛋白，抑制黑色素細(xì)胞凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)免疫過程等發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點(diǎn)Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 主要是通過細(xì)胞對(duì)肽激素的反應(yīng)、對(duì)肽激素的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)肽的反應(yīng)、對(duì)肽的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)等生物過程發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，甘草治療白癜風(fēng)的靶點(diǎn)主要涉及的信號(hào)通路包括C-型凝集素受體信號(hào)通路、人T 細(xì)胞白血病病毒1 型感染、癌癥通路、細(xì)胞衰老和凋亡、乙型肝炎等。其中C-型凝集素受體信號(hào)通路是通過識(shí)別病原、損傷以及腫瘤相關(guān)分子模式上的配體，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能的作用[26]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，甘草中的主要活性成分谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素與核心靶點(diǎn)VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 的結(jié)合能均小于0，表明甘草中的主要活性成分可以與核心靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，形成氫鍵相互作用，反映了甘草治療白癜風(fēng)具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，驗(yàn)證了使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法進(jìn)行篩選的合理性。

綜上所述，甘草可能通過谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素等活性成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、免疫功能、炎癥等相關(guān)通路中的核心靶點(diǎn)Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用，闡釋了甘草治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制，可以為甘草治療白癜風(fēng)的深入研究提供理論參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突