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        基于AMPK/NLRP3 通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡探究牡荊素對(duì)大鼠分泌性中耳炎的抑制作用

        2023-11-24 12:39:26李艷峰盧振民
        現(xiàn)代藥物與臨床 2023年10期

        李艷峰,盧振民

        新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,河南 新鄉(xiāng) 453100

        分泌性中耳炎為耳鼻喉科常見的疾病之一,是一種中耳非化膿性疾病,以中耳積液、聽力損傷及鼓膜渾濁內(nèi)陷為特征,常發(fā)病于兒童,且其發(fā)病率呈逐年增高態(tài)勢(shì),已經(jīng)成為危害人類身體健康的突出問題[1]。目前,有關(guān)于分泌性中耳炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,其病因機(jī)制仍然存在一定的爭(zhēng)議。多項(xiàng)研究證實(shí),炎癥效應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致中耳黏膜損傷及聽力受損的主要病因,通過改善機(jī)體免疫功能并予以抗炎處理是緩解分泌性中耳炎癥狀的重要方式[2-3]。細(xì)胞焦亡作為一種新型促炎性細(xì)胞死亡方式,能夠通過誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng),加速疾病進(jìn)展。研究證實(shí),細(xì)胞焦亡是一種依賴于Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式,主要是以pro-Caspase-1 活化形成Caspase-1 p20,誘導(dǎo)焦亡執(zhí)行蛋白消皮素 D(GSDMD)發(fā)生剪切形成具有細(xì)胞毒性的GSDMDN,并募集至細(xì)胞膜上形成焦亡小孔,促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18 釋放,進(jìn)而誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]。多項(xiàng)研究均已證實(shí),在多種炎癥相關(guān)性疾病中均存在細(xì)胞焦亡的發(fā)生,而通過藥物/基因干預(yù)細(xì)胞焦亡能夠抑制機(jī)體過度炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善疾病癥狀[5-6]。結(jié)合分泌性中耳炎以炎癥反應(yīng)為核心的疾病主要病理機(jī)制,提示細(xì)胞焦亡很有可能是分泌性中耳炎中耳黏膜損傷的新機(jī)制。腺苷酸活化蛋白激酶/NOD 樣受體蛋白3(AMPK/NLRP3)是細(xì)胞焦亡發(fā)生的重要調(diào)控通路,抑制或降低AMPK 活性能夠明顯激活NLRP3 炎癥小體,從而啟動(dòng)細(xì)胞焦亡[7]。此外,AMPK 和NLRP3 炎癥小體已被證實(shí)在分泌性中耳炎體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用[8-9]。以上研究共同提示,以AMPK/NLRP3通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為研究切入點(diǎn)可能是揭示分泌性中耳炎新的病理機(jī)制及以此探尋新型治療藥物的關(guān)鍵。

        牡荊素是一種天然的生物活性黃酮類化合物,多存在山楂葉及其果實(shí)、山里紅葉、金蓮花等中藥材中。研究證實(shí),牡荊素具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗腫瘤[12]等多種生物學(xué)功能,且對(duì)疾病的防治效果顯著,相比于臨床藥物具有不良反應(yīng)小、安全性高等優(yōu)勢(shì),是一種極具開發(fā)潛力的天然活性物質(zhì)。研究表明,牡荊素能夠通過抑制炎癥反應(yīng),改善關(guān)節(jié)炎大鼠癥狀[11]。此外,牡荊素亦能夠通過抑制炎癥反應(yīng),改善哮喘幼鼠肺部損傷[13]。但是,關(guān)于牡荊素對(duì)分泌性中耳炎炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制尚不清楚。為此,本研究擬通過內(nèi)毒素法構(gòu)建分泌性中耳炎大鼠模型,從AMPK/NLRP3 通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑,闡明牡荊素對(duì)分泌性中耳炎大鼠的保護(hù)作用,旨在為分泌性中耳炎臨床候選治療藥物提供新的選擇。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動(dòng)物 雄性,SPF 級(jí),周齡6~8 周,SD 大鼠50 只,體質(zhì)量為(200±10)g,購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2021-0026],動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,期間正常飲食、飲水。飼養(yǎng)條件:(25±2)℃,環(huán)境相對(duì)濕度55%~65%,晝夜各12 h 交替光照。本實(shí)驗(yàn)中涉及的動(dòng)物研究經(jīng)過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)號(hào)LLSC2021-06-010)。

        1.1.2 主要試劑 牡荊素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號(hào)20220312,成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司);內(nèi)毒素(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司,批號(hào)L6529);AMPK抑制劑6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-A]嘧啶(Compound C)(美國(guó)Selleck 公司,批號(hào)S7306);免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào)SP-9001);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β、IL-18 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0002、SEKR-0019);蘇木素-伊紅(HE)檢測(cè)試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ECL 發(fā)光液、β-actin 一抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)公司,批號(hào)C0105S、P0009、P0018FS、AF0003、A0412、A0408);p-AMPK 一抗、AMPK一抗、Caspase-1p20 一抗、GSDMD-N 一抗、IL-1β一抗、IL-18 一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology,批號(hào)2537、2532、89332、37349、63124、57058)。

        1.1.3 主要儀器 LD-96A 型酶標(biāo)儀(山東萊恩德智能科技有限公司);BX53 型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司);BX43 型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);580-NAVPR2 型ABR 電位儀(上海沫錦醫(yī)療器械有限公司);Gel dox XR+型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 分泌性中耳炎大鼠模型的構(gòu)建以及分組給藥 將50 只SD 大鼠隨機(jī)性分為對(duì)照組、模型組、牡荊素(3、12 mg/kg)組、牡荊素高劑量+Compound C 組,每組各10 只。顯微鏡下觀察大鼠外耳道及中耳感染情況排除中耳感染性大鼠。除對(duì)照組外,其余各組大鼠均采取內(nèi)毒素法復(fù)制分泌性中耳炎大鼠模型[14]:0.4%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,大鼠仰臥位固定,在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)鼓膜穿刺,采用微量注射器注射內(nèi)毒素(200 ng/mL)。造模后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠鼓膜渾濁、內(nèi)陷以及分泌液等狀況,若大鼠鼓膜出現(xiàn)明顯渾濁,內(nèi)陷且伴有氣泡形成,鼓室積液,視為模型構(gòu)建成功。建模后鼓膜充血,光錐消失,無穿孔。本實(shí)驗(yàn)中分泌性中耳炎大鼠造模成功率為100%。造模成功后1 d,牡荊素3、12 mg/kg組分別 ip 相應(yīng)劑量的牡荊素[15];牡荊素+Compound C 組ip 12 mg/kg 的牡荊素后,立即ip 20 mg/kg Compound C[16];對(duì)照組和模型組大鼠分別ip等量的生理鹽水。以上各組均為1 次/d,連續(xù)給藥21 d。

        1.2.2 中耳黏膜組織病理學(xué)觀察 給藥結(jié)束后各組大鼠均頸椎脫臼處死,解剖內(nèi)耳,4%多聚甲醛固定,脫鈣,脫水,石蠟包埋切片,行HE 染色,顯微鏡下觀察中耳黏膜組織病理形態(tài)變化。

        1.2.3 中耳黏膜厚度測(cè)定 將大鼠頸椎脫臼處死后,解剖頭部并分離聽泡,濾紙吸除聽泡水分,于顯微鏡下剝離中耳黏膜組織,最后利用測(cè)微計(jì)測(cè)定各組大鼠黏膜組織厚度,每組測(cè)量5 個(gè)不同位置,取其平均值為最終黏膜厚度。

        1.2.4 大鼠聽力功能檢測(cè) 各組大鼠給藥結(jié)束后24 h,采取聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)儀檢測(cè)ABR反應(yīng)閾值,以此反映聽力功能變化。各組大鼠麻醉后,置于隔聲屏蔽室內(nèi),依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]嚴(yán)格按照ABR 儀器操作方法進(jìn)行ABR 反應(yīng)閾值測(cè)定。

        1.2.5 ELISA 檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平 給藥結(jié)束后,大鼠腹主動(dòng)脈取血,4 ℃,3 000 r/min 離心10 min,吸取上清液,按照ELISA 檢測(cè)說明書測(cè)定各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平。

        1.2.6 免疫組化檢測(cè)中耳黏膜組織p-AMK、NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá) 將脫蠟、透明、脫水后的黏膜組織切片抗原修復(fù),經(jīng)3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)后,4 ℃孵育p-AMPK一抗(1∶200)、NLRP3 一抗(1∶500)過夜,室溫條件下孵育對(duì)應(yīng)二抗30 min,最后滴加DAB 顯色液,經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、封片處理,顯微鏡下觀察黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá),并經(jīng)Image J 軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

        1.2.7 Western blotting 檢測(cè)AMPK/NLRP3 通路及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組大鼠中耳黏膜組織,剪碎后混合加入蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液,于4 ℃條件下,裂解30 min。將離心管放置于離心機(jī)內(nèi)并設(shè)置:4 ℃、12 000 r/min 離心10 min,吸取上清液。BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,蛋白質(zhì)變性,蛋白上樣,電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫條件下PVDF 采用6%BSA 封閉1 h,TBST 洗膜后,4 ℃條件下,分別孵育p-AMPK 一抗(1∶500)、AMPK 一抗(1∶1 000)、NLRP3 一抗(1∶1 000)、Caspase-1 p20 一抗(1∶500)、GSDMD-N 一抗(1∶500)、IL-1β 一抗(1∶1 000)、IL-18 一抗(1∶1 000)、β-actin 一抗(1∶5 000)16 h。次日取出PVDF 膜,TBST 洗滌后加入相應(yīng)HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 孵育2 h。TBST 洗滌3 次,每次5 min。最后于PVDF膜上滴加顯影液顯影、拍照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image J 軟件進(jìn)行p-AMPK、AMPK、NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)定量分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 牡荊素對(duì)大鼠中耳黏膜病理形態(tài)改變和黏膜厚度的影響

        對(duì)照組大鼠中耳內(nèi)黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,血管及纖維細(xì)胞含量豐富,未有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。模型組大鼠中耳黏膜細(xì)胞腫脹,黏膜組織明顯增厚(P<0.05),有多處黏膜細(xì)胞脫落,壞死,可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠,黏膜上皮細(xì)胞排列較為規(guī)整,腫脹程度減輕,僅有少量的黏膜細(xì)胞脫落,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,中耳黏膜厚度降低(P<0.05),且伴隨牡荊素劑量的增加,中耳黏膜病理?yè)p傷及黏膜厚度均減輕。與牡荊素12 mg/kg 組相比,牡荊素+Compound C 組大鼠中耳黏膜組織病理?yè)p傷程度加重,且黏膜厚度增加(P<0.05),見圖1、表1。

        表1 各組大鼠中耳黏膜厚度比較(,n=10)Table 1 Comparison of thickness of middle ear mucosa in each group (,n=10)

        表1 各組大鼠中耳黏膜厚度比較(,n=10)Table 1 Comparison of thickness of middle ear mucosa in each group (,n=10)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1 組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        圖1 各組大鼠中耳病理學(xué)變化(HE,×200)Fig.1 Pathological changes in the middle ear of rats in each group (HE,×200)

        2.2 牡荊素對(duì)大鼠聽覺功能的影響

        與對(duì)照組相比,模型組大鼠ABR 反應(yīng)閾值明顯增加(P<0.05)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠ABR 反應(yīng)閾值明顯降低(P<0.05),且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg組相比,AMPK抑制劑Compound C 能夠增加大鼠ABR 反應(yīng)閾值(P<0.05),見表2。

        表2 各組大鼠ABR 反應(yīng)閾值比較(,n=10)Table 2 Comparison of ABR response thresholds in each group of rats (,n=10)

        表2 各組大鼠ABR 反應(yīng)閾值比較(,n=10)Table 2 Comparison of ABR response thresholds in each group of rats (,n=10)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1 組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        2.3 牡荊素對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平影響

        與對(duì)照組相比,模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明顯增加(P<0.05)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平均明顯降低(P<0.05),且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg 組相比,牡荊素+Compound C 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明顯增加(P<0.05),見表3。

        表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平比較(,n=10)Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18 levels in each group of rats (,n=10)

        表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平比較(,n=10)Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18 levels in each group of rats (,n=10)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        2.4 牡荊素對(duì)大鼠中耳黏膜細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        與對(duì)照組相比,模型組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.05),且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素12 mg/kg組相比,AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)(P<0.05),見圖2、表4。

        表4 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對(duì)表達(dá)量(,n=6)Table 4 Relative expression of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β,and IL-18 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

        表4 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相對(duì)表達(dá)量(,n=6)Table 4 Relative expression of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β,and IL-18 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        圖2 各組大鼠中耳黏膜組織Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β and IL-18 proteins in middle ear mucosa of rats in each group

        2.5 牡荊素對(duì)大鼠黏膜組織中AMPK/NLRP3 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

        免疫組化染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 陽(yáng)性表達(dá)明顯減少,NLRP3 陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P<0.05)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg 組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 陽(yáng)性表達(dá)顯著增加,NLRP3 陽(yáng)性表達(dá)明顯減少,且呈劑量相關(guān)(P<0.05)。與牡荊素12 mg/kg組相比,AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)p-AMPK、NLRP3 陽(yáng)性表達(dá)(P<0.05),見圖3、表5。Western blotting 檢測(cè)顯示,模型組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 蛋白表達(dá)降低,NLRP3 蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。與模型組相比,牡荊素3、12 mg/kg組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK 蛋白表達(dá)升高,NLRP3 蛋白表達(dá)降低(P<0.05),且呈劑量相關(guān)性。與牡荊素 12 mg/kg 組相比,AMPK 抑制劑Compound C 能夠明顯逆轉(zhuǎn)p-AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá)(P<0.05),見圖4、表6。

        表5 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較結(jié)果(,n=6)Table 5 Comparison of p-AMPK and NLRP3 protein positive expression in middle ear mucosa tissues of rats in each group (,n=6)

        表5 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、NLRP3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較結(jié)果(,n=6)Table 5 Comparison of p-AMPK and NLRP3 protein positive expression in middle ear mucosa tissues of rats in each group (,n=6)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1 組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        表6 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK/AMPK、NLRP3 蛋白相對(duì)表達(dá)量(,n=6)Table 6 Relative expression of p-AMPK/AMPK and NLRP3 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

        表6 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK/AMPK、NLRP3 蛋白相對(duì)表達(dá)量(,n=6)Table 6 Relative expression of p-AMPK/AMPK and NLRP3 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

        與對(duì)照組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05;與牡荊素3 mg·kg-1 組比較:&P<0.05;與牡荊素12 mg·kg-1 組比較:@P<0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

        圖3 免疫組化檢測(cè)p-AMPK、NLRP3 陽(yáng)性表達(dá)(IHC,×200)Fig.3 Immunohistochemical detection of positive expression of p-AMPK and NLRP3 (IHC,× 200)

        圖4 各組大鼠中耳黏膜組織p-AMPK、AMPK、NLRP3蛋白凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of p-AMPK,AMPK and NLRP3 protein in middle ear mucosa of rats in each group

        3 討論

        中耳炎可分為化膿性和非化膿性中耳炎,是由多種原因誘發(fā)的中耳全部或部分中耳炎性病變。非化膿性中耳炎是導(dǎo)致兒童聽力損傷以及言語(yǔ)功能障礙的臨床常見疾病,具有一定的自限性,但是仍有20%~40%患者會(huì)出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量[17]。因此,積極探尋分泌性中耳炎的病因及機(jī)制并予以藥物干預(yù)治療是臨床治療規(guī)范方案治療的前提。

        炎癥基因和細(xì)胞因子誘發(fā)的免疫炎癥是分泌性中耳炎的主要致病因素,抑制炎癥細(xì)胞因子釋放,可顯著恢復(fù)中耳通氣,改善分泌性中耳炎[18-19]。牡荊素主要是從山楂葉總黃酮分離、純化而得到的活性單體化合物,具有顯著的抗炎作用,能夠明顯減輕關(guān)節(jié)炎癥狀,并通過抑制炎癥因子表達(dá)改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[20]?;谝陨涎芯?,推測(cè)牡荊素可能通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮分泌性中耳炎治療作用。

        本研究通過構(gòu)建分泌性中耳炎大鼠模型,觀察牡荊素對(duì)其治療作用。研究發(fā)現(xiàn),牡荊素能夠通過抑制炎癥因子釋放,改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜病理性損傷。但是,有關(guān)牡荊素是通過何種機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用尚未完全闡明。細(xì)胞焦亡為炎癥性細(xì)胞死亡方式,廣泛參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究已證實(shí),抑制Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡能夠明顯降低炎癥因子釋放,進(jìn)而改善疾病癥狀[21-22]。袁玥等[23]研究證實(shí),細(xì)胞焦亡的發(fā)生及其過程中的相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子的釋放,會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大,加重氣道炎癥性疾病的進(jìn)展,提示細(xì)胞焦亡可能參與分泌性中耳炎炎癥反應(yīng)過程。Ding 等[24]研究證實(shí),牡荊素能夠通過抑制GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,降低炎癥因子水平,進(jìn)而緩解草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎結(jié)石小鼠癥狀。既往研究共同提示,牡荊素可能通過調(diào)控細(xì)胞焦亡通路發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用。基于此,本研究檢測(cè)了焦亡相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)牡荊素能夠明顯抑制焦亡相關(guān)蛋白表達(dá),降低炎癥反應(yīng),進(jìn)而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷。AMPK/NLRP3 信號(hào)通路是與細(xì)胞焦亡發(fā)生密切相關(guān)。研究證實(shí),NLRP3 炎癥小體的組裝是激活細(xì)胞焦亡過程中關(guān)鍵基因Caspase-1 的前體,當(dāng)細(xì)胞受到外界危險(xiǎn)信號(hào)刺激后,NLRP3、ASC 及pro-Caspase-1 三者會(huì)組裝為NLRP3 炎癥小體蛋白復(fù)合物,導(dǎo)致pro-Caspase-1 裂解形成具有活性的cleaved-Caspase-1(Caspase-1p20)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生[25],此過程可由AMPK 通路調(diào)控[26]。此外,抑制AMPK信號(hào)通路可顯著促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化,從而啟動(dòng)細(xì)胞焦亡[27]。以往研究也證實(shí),AMPK 和NLRP3 炎癥小體參與中耳炎疾病的發(fā)生發(fā)展,激活A(yù)MPK 通路或是抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞及中耳黏膜的損傷[28-29],提示AMPK、NLRP3 基因可能是分泌性中耳炎疾病發(fā)生的重要調(diào)控因子。此外,Zhang 等[30]研究證實(shí),牡荊素能夠通過抑制NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善慢性腦缺血性神經(jīng)損傷。Inamdar 等[31]研究發(fā)現(xiàn),牡荊素能夠通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路,改善高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝病變。以上研究共同表明,牡荊素很有可能通過調(diào)控AMPK、NLRP3 蛋白表達(dá),發(fā)揮抗分泌性中耳炎作用。本研究結(jié)果顯示,與模型組相比,牡荊素能夠激活A(yù)MPK 通路,抑制NLRP3 蛋白表達(dá),從而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷,表明牡荊素可能通過調(diào)控AMPK/NLRP3 通路,抑制分泌性中耳炎大鼠細(xì)胞焦亡。鄧宏哲等[32]研究證實(shí),人參皂苷Rg1 能夠通過激活A(yù)MPK 途徑抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,發(fā)揮抗博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化保護(hù)作用,且此保護(hù)作用可被AMPK 抑制劑Compound C 逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步明確AMPK/NLRP3 通路在牡荊素抑制分泌性中耳炎中的作用,本研究通過對(duì)牡荊素高劑量大鼠ip AMPK 抑制劑,觀察牡荊素對(duì)大鼠分泌性中耳炎的作用能否被逆轉(zhuǎn)。結(jié)果顯示,與牡荊素組相比,AMPK 抑制劑Compound C 能夠抑制AMPK 通路,促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,誘發(fā)炎癥反應(yīng),損害分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜組織,從而逆轉(zhuǎn)牡荊素對(duì)分泌性中耳炎的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了牡荊素改善大鼠分泌性中耳炎與調(diào)控AMPK/NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)。

        綜上所述,本研究通過探討牡荊素對(duì)分泌性中耳炎大鼠炎癥的影響及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),牡荊素能夠通過活化AMPK,抑制NLRP3 炎癥小體活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,減輕炎癥反應(yīng),從而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜損傷。

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