章 豪 陳山喬 江瀟瀟 吳銀良 朱 勇 陳 國(guó)

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（寧波），浙江寧波 315040)

0 引言

真菌毒素是由真菌天然生成的次生代謝物[1]。真菌毒素種類(lèi)繁多，可污染多種水果、谷物和糧食[2]。由于具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性且可耐受不同形式的分解，許多此類(lèi)物質(zhì)都具有致癌性、雌激素活性和毒性作用[3]。真菌毒素一直屬于歐洲食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)(RASFF)中通報(bào)的最高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)別，它們?cè)诼燥嬍筹L(fēng)險(xiǎn)因素中位居榜首，優(yōu)先級(jí)高于合成污染物、植物毒素、食品添加劑或農(nóng)藥殘留[4]。因此，全世界出臺(tái)了多種法規(guī)，規(guī)定了特定真菌毒素的允許限值[5]。

世界上許多國(guó)家均在進(jìn)行毒性、發(fā)生率和消費(fèi)數(shù)據(jù)以及經(jīng)濟(jì)和政治方面的全面風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后，對(duì)常見(jiàn)真菌毒素實(shí)行了管制[6]。例如，歐盟委員會(huì)法規(guī)No.1881/2006（及后續(xù)修正案）規(guī)定了不同食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2、伏馬菌素B1 和B2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和曲霉毒素A 的最高允許濃度(MPL)，并為T(mén)-2 和HT-2 毒素設(shè)定了指導(dǎo)限值[7]。糧谷被視為真菌毒素污染的高風(fēng)險(xiǎn)商品，攝取的糧谷僅含ppb (μg/kg)濃度的真菌毒素就有可能引發(fā)嚴(yán)重疾病[8]。EFSA 的最新科學(xué)意見(jiàn)將雪腐鐮刀菌烯醇的每日可耐受攝入量(TDI)確定為每日每kg 體重1.2μg，其最高平均濃度通常見(jiàn)于燕麥、玉米、大麥和小麥產(chǎn)品中[9]。2018 年，RASFF 門(mén)戶(hù)網(wǎng)站發(fā)布了25份有關(guān)谷物中嚴(yán)重真菌毒素污染的通報(bào)[10]。

農(nóng)產(chǎn)品中小麥、大米和玉米等是最易受到污染的谷物，因此也是監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)[11]。這些谷物中有許多天然成分都是UPLC-MS/MS 分析的干擾物[12]。采用直通式凈化方法開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速的樣品前處理方案和UPLC-MS/MS 分析方法，以小麥為例分析了6 種真菌毒素。該方法簡(jiǎn)單、快速、有效，能滿(mǎn)足多種糧谷中真菌毒素的檢測(cè)需要。

1 試驗(yàn)資料

1.1 儀器、試劑與材料

美國(guó)Waters 公司UPLC XevoTMTQ-MS 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，德國(guó)IKA 公司Vortex Genie 3 漩渦振蕩器，德國(guó)Sigma 公司低溫高速離心機(jī)。

德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、HT-2、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇、雜色曲霉毒素，甲酸（色譜純）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)?。ň_到0.1mg）適量6 種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈溶解，然后配制1g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃溫度下保存。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，然后置于100mL 的容量瓶?jī)?nèi)，乙腈稀釋。配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10mg/L 后，-20℃溫度下保存。

1.2.2 樣品處理

50mL 離心管中加小麥樣品2.00g，水2mL，渦旋振蕩1min 后加乙腈8mL，于自動(dòng)振蕩器內(nèi)振蕩30min。高速離心5min，取上清液，至Oasis HLB 固相萃取小柱，再收集流出液于40℃溫度下氮?dú)獯蹈?；?mL 的0.1%(v/v)甲酸水溶液-（90:10,v/v）乙腈溶液溶解，再渦旋振蕩，然后過(guò)0.22μm 的濾膜。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（1.7μm，100mm×2.1mm)；流動(dòng)相：A 相為0.1%(v/v)甲酸水溶液，B 相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0min，10%B；1.0～5.0min，10%B ～90%B；5.0 ～6.5min，90%B；6.5 ～6.6min，90%B ～10%B；6.6 ～8.0min，10%B；流速0.30mL/min；進(jìn)樣量10μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

真菌毒素相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種真菌毒素的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果

2.1 儀器條件優(yōu)化

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基于LC-MS/MS 測(cè)定真菌毒素大多采用ESI 源正離子模式電離的分析方法[12-22]。本試驗(yàn)具體離子等信息如表1 所示。

2.2 固相萃取小柱的選擇

本試驗(yàn)對(duì)QuEChERS 和Oasis HLB 兩種方法進(jìn)行了比較。從小麥中選取陰性樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，無(wú)需活化、洗脫和淋洗等步驟，采用Oasis HLB 固相萃取小柱進(jìn)行凈化后，回收率、基質(zhì)干擾均優(yōu)于QuEChERS 凈化結(jié)果。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

小麥中6 種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、定量限見(jiàn)表2。

表2 6種真菌毒素在小麥中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.4 回收率與精密度

圖1 為小麥空白樣品中真菌毒素加標(biāo)MRM 色譜圖。

圖1 小麥加標(biāo)樣品的MRM色譜圖

6 種真菌毒素在小麥中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。

表3 6種真菌毒素在小麥中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 方法應(yīng)用

采用優(yōu)化后的儀器條件和前處理?xiàng)l件分別對(duì)隨機(jī)采集的50 個(gè)小麥樣品進(jìn)行分析，在5 個(gè)樣品中檢出了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，含量范圍為25.2 ～50.3μg/kg。

3 結(jié)論

本文采用直通式凈化方法開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速的樣品前處理方案和UPLC-MS/MS 分析方法，以小麥為例分析了6 種真菌毒素。該方法簡(jiǎn)單、快速、有效，能滿(mǎn)足多種糧谷中真菌毒素的檢測(cè)需要。