陶婷，劉子博，張婷，許莉，代琪，蒲旭峰▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.成都市藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610045)

虎杖為中醫(yī)臨床常用中藥，來源于蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和根莖，具有多重功效[1，2]。現(xiàn)代藥理研究表明，虎杖還具有調(diào)血脂[3，4]、抗炎[5]、抗感染[6]、抗氧化[7]、抗肝纖維化[8]、保護(hù)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)[9，10]等作用。課題組前期研究了虎杖降脂的活性成分和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素具有調(diào)節(jié)血脂的作用[11]，從虎杖降脂作用角度出發(fā)，現(xiàn)有研究大部分是基于虎杖中某一種成分的提取工藝考察[12，13]，然而中藥療效的發(fā)揮不僅僅依靠一種成分，是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。因此，優(yōu)化虎杖提取工藝，最大限度提高有效成分含量顯得尤為重要?；诖?，本研究以虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素為考察指標(biāo)進(jìn)行虎杖提取工藝的優(yōu)化，并將不同產(chǎn)地的虎杖按優(yōu)化的提取工藝制備虎杖提取物，初步建立了虎杖提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期提升虎杖藥材的利用與開發(fā)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

虎杖(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號(hào)：2103062)；虎杖苷(批號(hào)：111575-201603，純度≥87.3%)、白藜蘆醇(批號(hào)：111535-201703，純度≥99.4%)、大黃素(批號(hào)：110756-201913，純度≥96.0%)對(duì)照品均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1200 Infinity高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；TLC Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；?？芃PE高通量真空平行濃縮儀(?？萍瘓F(tuán)股份有限公司)；XPE26電子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.001 mg)；ME-204E電子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.1 mg)；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華儀器制造有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取虎杖苷、大黃素和白藜蘆醇對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中；再各精密吸取1 mL加甲醇定容至10 mL量瓶中，配制成含虎杖苷3.014 8 mg/mL、白藜蘆醇 0.511 7 mg/mL、大黃素1.007 2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取虎杖粉末0.2 g，精密稱定，加入適宜濃度乙醇30 mL，稱定重量，固定提取時(shí)間和溫度回流提取，取出并冷卻，再次稱定重量，補(bǔ)足失重，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX EcLipse PLus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)?-20 min，10%-25%A；20-45 min，25%-38%A；45-55 min，38%-100%A；55-60 min，100%-10%A;60-65 min,10%A。流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，柱溫40 ℃。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL混合對(duì)照品溶液，分別加甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得6個(gè)不同濃度梯度的溶液。照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積Y，并對(duì)其濃度X(mg/mL)進(jìn)行線性回歸處理。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

將“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的峰面積，計(jì)算6次結(jié)果中各成分峰面積的RSD值。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的峰面積，計(jì)算6份供試品溶液中各成分含量的RSD值。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

照“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h取供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積并計(jì)算峰面積的RSD值。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

平行取6份0.2 g虎杖粉末，根據(jù)各成分回歸方程計(jì)算出其中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的含量，加入與各成分等量的對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄各成分的峰面積，計(jì)算3種成分的平均回收率和RSD值。

2.6 單因素試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下供試品提取方法，依次考察各因素對(duì)虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素含量的影響。乙醇濃度考察梯度為50%、60%、70%、80%、90%，提取時(shí)間考察梯度為30、60、90、120、150 min，提取溫度考察梯度為50、60、70、80、90 ℃。

2.7 層次分析法計(jì)算綜合評(píng)分

參考文獻(xiàn)方法[14-16]，將虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素含量作為權(quán)重指標(biāo)予以量化。參照藥典虎杖藥材的評(píng)價(jià)指標(biāo)，將3個(gè)指標(biāo)分為2個(gè)層次，并確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)榛⒄溶?大黃素>白藜蘆醇。采用層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)量化3個(gè)指標(biāo)成分的權(quán)重系數(shù)，得到虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的權(quán)重系數(shù)分別為0.429、0.142、0.429。綜合評(píng)分Y(%)=(DiJ虎杖苷×0.429+DiJ白藜蘆醇×0.142+DiJ大黃素×0.429)×100%，DiJ=某指標(biāo)值/某指標(biāo)值中的最大值。

2.8 響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖提取工藝

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)為自變量，綜合評(píng)分(Y)為因變量，運(yùn)用Design-Expert-8.0.6軟件得出不同實(shí)驗(yàn)組合條件，根據(jù)綜合評(píng)分(Y)篩選出最優(yōu)提取條件。

2.9 虎杖提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步研究

2.9.1 虎杖提取物的制備

各取10批不同產(chǎn)地虎杖藥材粉末20.0 g，精密稱定，采用響應(yīng)面優(yōu)化出的最佳工藝制備，減壓濃縮，真空干燥成粉末，得到10批虎杖提取物粉末。

2.9.2 薄層鑒別

參照2020版《中國(guó)藥典》與文獻(xiàn)[17]，取“2.9.1”項(xiàng)下虎杖提取物粉末0.1 g，平行3份，各加甲醇5 mL，超聲30 min，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取虎杖對(duì)照藥材1.0 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。另取1 mg/mL虎杖苷對(duì)照品、1 mg/mL大黃素對(duì)照品甲醇溶液。分別吸取2 μL供試品溶液和對(duì)照藥材溶液，10 μL虎杖苷對(duì)照品溶液點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸-水體積比(4∶5∶0.5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，分別置紫外光燈(365 nm)和日光下檢視相應(yīng)斑點(diǎn)。另取一硅膠G薄層板，各吸取5 μL供試品溶液和對(duì)照藥材溶液，10 μL大黃素對(duì)照品溶液，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比4∶1∶0.1)為展開劑，同法展開，置紫外光燈(365 nm)下檢視大黃素?zé)晒獍唿c(diǎn)，氨蒸汽熏后再置日光下檢視。

2.9.3 水分檢查

參照2020版《中國(guó)藥典》通則0832項(xiàng)下水分測(cè)定法第二法(烘干法)，測(cè)定10批虎杖提取物水分范圍。

2.9.4 含量測(cè)定

取“2.9.1”項(xiàng)下10批虎杖提取物粉末各0.2 g，精密稱定，加入甲醇30 mL，溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的峰面積，計(jì)算三者含量。

2.9.5 指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

將“2.9.4”項(xiàng)下得到的10批虎杖提取物色譜圖的cdf信號(hào)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》，以S2作為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法生成虎杖疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜圖及線性回歸方程

混合對(duì)照品和供試品溶液色譜圖見圖1。如圖所示，供試品色譜圖中虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的保留時(shí)間與混合對(duì)照品中的保留時(shí)間基本一致，且各成分分離度良好，可滿足分析檢測(cè)的要求。通過對(duì)虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素峰面積對(duì)濃度的線性關(guān)系考察，得到虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y1=26 585.425 1X1-214.158 2。X1范圍為0.030 1-0.301 5 mg/mL；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y2=70 812.847 9X2-102.976 6，X2范圍為0.005 1-0.051 2 mg/mL；大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y3=38 362.858 7X3+19.023 0。X3范圍為0.010 1-0.100 7 mg/mL。

圖1 混合對(duì)照品溶液(A)與供試品溶液(B)的高效液相色譜圖

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)得出，混合對(duì)照品6次進(jìn)樣中虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素峰面積的RSD值分別為0.29%、0.12%、0.12%，結(jié)果表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)得出，6份供試品溶液中虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素含量的RSD值分別為1.18%、1.55%、1.40%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)得出，供試品溶液在0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素峰面積的RSD值分別為0.96%、2.52%、0.79%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率試驗(yàn)得出，虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素的平均回收率分別為100.66%、99.42%、101.59%，RSD值分別為1.88%、2.63%、1.75%，結(jié)果表明加樣回收率合格。

3.3 單因素考察結(jié)果

如圖2所示，乙醇濃度的改變對(duì)虎杖苷含量影響較大，在60%乙醇濃度時(shí)達(dá)到峰值，之后急劇下降，而白藜蘆醇和大黃素含量則隨乙醇濃度的增加有較小幅度的增加。有相關(guān)研究表明隨著乙醇濃度的增大，其他雜質(zhì)的溶出量隨之增加，虎杖苷提取率也隨之下降[18]。因此，響應(yīng)面分析中乙醇濃度設(shè)置為50%、60%、70%。在對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，90 min時(shí)3種成分的含量達(dá)到峰值，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)而部分成分發(fā)生了氧化[19]。故選取 60、90、120 min的提取時(shí)間為響應(yīng)面分析水平。提取溫度在60℃時(shí)3種成分含量都出現(xiàn)了最大值，其他學(xué)者的研究也證實(shí)了大黃素和白藜蘆醇的含量受溫度的影響較大，較高的溫度有利于大黃素溶解，但溫度太高反而會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)和大黃素氧化分解[20]；對(duì)于白藜蘆醇這一熱敏性物質(zhì)來說，升高溫度反而是不利的[21]。因此，選取50、60、70℃的提取溫度為響應(yīng)面分析水平。

圖2 不同因素對(duì)虎杖主要有效成分含量的影響

3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度的取值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。因素與水平設(shè)計(jì)見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert-8.0.6軟件對(duì)表2中綜合評(píng)分Y進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸方程Y=98.41+1.37A-4.45B+0.60C-0.02AB+0.66AC+0.22BC-2.35A2-4.10B2+0.72C2。由表3可知，該回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.764 8)，說明模型預(yù)測(cè)性及擬合度良好，可用于虎杖最佳提取工藝的篩選。模型的一次項(xiàng)A、B項(xiàng)及二次項(xiàng)A2、B2顯著(P<0.05)，表明乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分Y的影響較大，結(jié)合F值判斷出各因素對(duì)綜合評(píng)分Y的影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間B>乙醇濃度A>提取溫度C。

表3 方差分析結(jié)果

3D響應(yīng)面圖和等高線圖見圖3。響應(yīng)面的坡度和等高線的形狀可以反映出各因素交互作用的強(qiáng)弱。坡度越大，說明因素對(duì)響應(yīng)值影響越大；等高線越密集，形狀趨于橢圓，說明交互作用越強(qiáng)[22-25]。由圖3可以看出，提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分Y的影響最大，其次是乙醇濃度，最后是提取溫度。這與模型擬合結(jié)果一致。預(yù)測(cè)虎杖最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度60%，提取時(shí)間75 min，提取溫度70 ℃，綜合評(píng)分Y為99.93%。按響應(yīng)面優(yōu)化的提取工藝重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，綜合評(píng)分Y為98.855%±1.145%。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可行。

圖3 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分Y影響的3D響應(yīng)面圖與等高線圖

3.5 虎杖苷及大黃素薄層鑒別結(jié)果

如圖4、5，1-3 供試品與虎杖對(duì)照藥材斑點(diǎn)一致，說明虎杖是正品。與虎杖苷對(duì)照品斑點(diǎn)比較，紫外光燈(365 nm)下，供試品和對(duì)照藥材均在同一位置顯出藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰、位置適中，日光下未見明顯斑點(diǎn)，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。說明該展開方法可用于虎杖苷的薄層鑒別，觀察條件為紫外光燈(365 nm)更為適宜。與大黃素對(duì)照品斑點(diǎn)比較，供試品與虎杖對(duì)照藥材在紫外光燈(365 nm)下均顯出黃色熒光斑點(diǎn)，日光下均顯出紅色斑點(diǎn)，說明該展開方法穩(wěn)定可行，可用于大黃素薄層鑒別。

注:1-3 供試品;4.虎杖對(duì)照藥材;5.虎杖苷對(duì)照品

注:1-3 供試品;4.虎杖對(duì)照藥材;5.大黃素對(duì)照品

3.6 水分與含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，10批虎杖提取物的水分含量在2.83%-5.17%之間。所以建議虎杖提取物粉末水分不超過6.00%。10批提取物中虎杖苷含量范圍為15.19-36.36 mg/g，白藜蘆醇含量范圍為0.95-5.71 mg/g，大黃素含量范圍為5.20-15.47 mg/g。所用10批虎杖藥材按《中國(guó)藥典》檢驗(yàn)均符合規(guī)定，為合格藥材，按照擬定工藝制備提取物，故擬定限度約為所得提取物低限的95%。初步確定虎杖提取物粉末中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素含量分別不得少于15.10、0.90、5.00 mg/g。

3.7 指紋圖譜分析結(jié)果

結(jié)果見圖6，指紋圖譜共確定了11個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中3個(gè)成分，分別為虎杖苷(3)、白藜蘆醇(5)、大黃素(10)。10批提取物與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.90，符合指紋圖譜的要求，見表4。

表4 虎杖藥材產(chǎn)地信息表及指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖6 10批虎杖提取物的HPLC指紋圖譜疊加圖及對(duì)照?qǐng)D譜(R)

4 討論

4.1 考察指標(biāo)和工藝參數(shù)的確定

本課題組前期研究了虎杖治療高脂血癥的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)，考察了虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素的體外降脂作用，結(jié)果三者都有較好的調(diào)節(jié)血脂作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小劑量虎杖提取物治療作用較差，而加大劑量又增加了胃腸道等不良反應(yīng)的發(fā)生。所以，設(shè)想選擇3種有效成分作為提取工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)，并運(yùn)用綜合評(píng)分作為工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期為虎杖制劑開發(fā)提供理論依據(jù)。前期的方案是考察乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，液料比這一工藝參數(shù)的考察意義不大，隨著溶液體積的增加，有效成分含量無最高值，所以將其舍棄。增加了對(duì)提取溫度的考察，因?yàn)榇蟛糠炙幉碾S著提取溫度的升高，提取率和有效成分溶出度都會(huì)增加，但是溫度升高到一定值時(shí)，也會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，反而降低提取率，故確定乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度為工藝優(yōu)化的考察參數(shù)。

4.2 薄層鑒別供試品溶液制備方法的確定

前期考察了兩種制備方法，第一種方法是參考藥典對(duì)虎杖大黃素的鑒別方法，第二種方法是“2.9.2”中描述的供試品溶液制備方法。結(jié)果顯示，第二種方法相較于第一種方法大黃素展開效果較好且提取步驟簡(jiǎn)單，故選擇第二種方法制備供試品溶液。

4.3 虎杖苷、大黃素展開劑的確定

初期參考文獻(xiàn)[17]中虎杖苷的展開劑為三氯甲烷-丙酮-甲酸-水(體積比4∶4∶0.5∶0.2)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，虎杖苷熒光斑點(diǎn)位置靠下，之后嘗試加大展開劑極性，改為三氯甲烷-丙酮-甲酸-水(體積比4∶5∶0.5∶0.2)，結(jié)果顯示斑點(diǎn)位置適中，符合薄層鑒別分析要求，故選擇后者作為虎杖苷展開劑。大黃素展開劑最初參考的是藥典中虎杖鑒別項(xiàng)下大黃素的展開溶劑，結(jié)果并不理想，最后參考藥典中連花清瘟膠囊鑒別項(xiàng)下大黃對(duì)照藥材的展開劑，環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(體積比4∶1∶0.1)，相較于前者，后者大黃素斑點(diǎn)更清晰且與其他大黃素類成分分離度更好，便于分辨，故選擇后者作為大黃素展開劑。

綜上，本研究采用單因素法考察了乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)3種成分含量的影響，確定各因素的響應(yīng)面分析水平，再結(jié)合綜合評(píng)分反映出各因素直接的交互關(guān)系，最終虎杖最佳提取工藝為乙醇濃度60%、提取時(shí)間75 min、提取溫度70 ℃。在此基礎(chǔ)上制備了10 批虎杖提取物建立虎杖提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中規(guī)定水分不得過6.00%；按干燥品計(jì)算，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素含量分別不得少于15.10、0.90、5.00 mg/g。