赫英姿 于庭洪 賈 姝 趙 翀 左玲玲 宋 策

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

柞蠶微粒子病是柞蠶的主要傳染性病害之一,用光學(xué)顯微鏡檢查微孢子蟲仍然是生產(chǎn)上較為直接的診斷方法。針對我國人口老齡化導(dǎo)致用工荒加劇和目前柞蠶繁種地區(qū)北移使得種繭微孢子蟲感染比例降低的現(xiàn)狀[1-2],柞蠶集團(tuán)母蛾鏡檢提上日程。不同于桑蠶集團(tuán)母蛾鏡檢,桑蠶滯育后為集團(tuán)母蛾鏡檢預(yù)留了時間,而柞蠶集團(tuán)母蛾鏡檢需要當(dāng)日完成。為了提高檢出率,對研磨液進(jìn)行離心處理,而離心后鏡檢檢出率與不離心相比有無差別,尤其是與純凈孢子液(清水稀釋液)相比,脂肪細(xì)胞的大量存在是否影響微孢子蟲的檢出率,是此項工作需要探討的問題。為此進(jìn)行了以下技術(shù)處理方法試驗。

1 材料與方法

1.1 供試材料

柞蠶微孢子蟲由患病柞蠶母蛾中分離提取,制成純孢子懸浮液,計數(shù)后貯存于4 ℃冰箱中備用,常規(guī)鏡檢無銹母蛾若干。

普通血球計數(shù)板一塊;TD-4低速臺式離心機(jī)一臺,由江陰保利器械有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

鏡檢方法分為常規(guī)鏡檢和離心鏡檢,以上檢查均是在光學(xué)顯微鏡(640倍)下觀察、統(tǒng)計;離心采用3 000 r/min轉(zhuǎn)3 min。

稀釋液分為清水、90%清水+10%蛾脂肪(水和脂肪按照體積比混合)兩種。

用血球計數(shù)板測出孢子懸浮液濃度為1×108個/mL,根據(jù)經(jīng)驗配制了1×106個/mL、1×105個/mL、9×104個/mL、1×104個/mL、1×103個/mL、1×102個/mL幾個濃度的溶液,鏡檢每片取樣量為20 μL。

1.3 調(diào)查方法

鏡檢結(jié)果分為5個視野可見微孢子蟲和6-10個視野可見微孢子蟲兩種,每處理3次重復(fù)。每次鏡檢凡看到微孢子蟲無論數(shù)量多少記為1、未見到微孢子蟲記為0,以幾率值計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)鏡檢

2.1.1 稀釋液為清水的各個濃度微孢子蟲檢出率

當(dāng)稀釋液為清水時,視野里比較純凈,微孢子蟲形態(tài)易于識別,只要有孢子出現(xiàn)就能看到,不容易漏檢。缺點(diǎn)是捕捉視野比較困難。1×105個/mL濃度是個比較臨界的濃度,前5個視野能檢出孢子是生產(chǎn)上十分必要的環(huán)節(jié),當(dāng)?shù)陀谶@個濃度時,極易造成漏檢。具體見表1。

表1 稀釋液為清水時微孢子蟲檢出情況

2.1.2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪各個濃度微孢子蟲檢出率

根據(jù)表1結(jié)果,在稀釋液中加入10%蛾脂肪,有了脂肪球,視野捕捉容易,但是視野清晰度會變差,在檢出臨界點(diǎn)濃度1×105個/mL上,即每個視野能見到一個孢子,脂肪球等的干擾會影響檢出率。具體如表2。

表2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪時微孢子蟲檢出情況

2.2 離心處理后鏡檢

2.2.1 稀釋液為清水時離心沉淀各個濃度微孢子蟲檢出率

將含有一定量微孢子蟲的液體離心沉淀,當(dāng)稀釋液為清水時,1×104個/mL處理濃度,離心沉淀3個重復(fù)前5個視野均檢出孢子;1×103個/mL處理中有兩個重復(fù)前5個視野檢出孢子,另外一個重復(fù)中前10個視野檢出孢子;1×102個/mL處理全部視野檢不出孢子。具體見表3。

表3 清水稀釋液離心沉淀后微孢子蟲檢出情況

表3結(jié)果表明,當(dāng)孢子濃度低至1×104/(個/mL)且稀釋液為清水時,通過離心富集的方法,可以很容易檢出孢子,但當(dāng)孢子濃度進(jìn)一步低時,達(dá)到100個/mL,離心仍未檢測出孢子。

2.2.2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪離心沉淀各個濃度微孢子蟲檢出率

當(dāng)稀釋液為清水+脂肪時,離心沉淀由于脂肪球的密集干擾,鏡下視野觀察較清水稀釋液困難,1×104/(個/mL)、1×103/(個/mL)都僅有1個重復(fù)前5個視野檢出孢子,1個重復(fù)10個視野檢出孢子,1個重復(fù)始終沒檢出孢子;但同時由于有脂肪球的指示作用,捕捉視野較清水稀釋液容易,因此1×102/(個/mL)處理中1個重復(fù)前5個視野檢出孢子,但另外兩個重復(fù)始終檢不出孢子。具體見表4。

表4 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪離心沉淀后微孢子蟲檢出情況

3 討 論

3.1 柞蠶微粒子病由于胚種傳染的特點(diǎn)使其成為生產(chǎn)中毀滅性的傳染性病害,為避免其危害,研發(fā)出了免疫學(xué)和分子生物學(xué)等具有很高的靈敏度檢測技術(shù),即使樣品中微孢子蟲濃度為1×102個/mL,檢出率仍達(dá)到90%,但當(dāng)樣品為感染微粒子病病蛾時,這些檢測技術(shù)的靈敏度大幅下降[3]。顯微鏡檢測母蛾技術(shù)在孢子檢出率上要求樣品中孢子達(dá)到一定濃度方可檢出,劉仁華等人[4]指出1×104個/mL是集團(tuán)母蛾鏡檢是否檢出的濃度臨界值,低于這個濃度檢出概率為0～1,高于這個濃度檢出概率為1。那么,在柞蠶生產(chǎn)中,新鮮母蛾脂肪干擾前提下,集團(tuán)母蛾鏡檢的檢出率怎樣,是否還遵循上面的規(guī)律,還需要試驗驗證。

3.2 本次試驗通過比較稀釋液中有無鮮蛾脂肪球,發(fā)現(xiàn)鮮蛾脂肪球的存在會影響孢子的檢出率。光學(xué)顯微鏡下當(dāng)孢子濃度為1×105個/mL左右時,在清水稀釋液純凈孢子中,10個視野3個重復(fù)均檢出孢子,加入10%蛾脂肪后,檢出率會變差,全部10個視野有一個重復(fù)始終未檢出孢子;當(dāng)孢子濃度為9×104個/mL時,稀釋液無論有無脂肪球干擾,都只有一個重復(fù)全部10個視野觀察到孢子,且數(shù)量僅為1個;當(dāng)孢子濃度為1×104個/mL時,稀釋液無論有無脂肪球,都觀察不到孢子。通過離心極大提高孢子的檢出率,即使孢子濃度低至1×103個/mL時,清水稀釋液全部10個視野均能檢出孢子,當(dāng)加入了蛾脂肪球后,離心處理后微孢子蟲檢出率也有所下降,前5個視野檢出概率較清水低,且全部10個視野有一個重復(fù)始終檢不出孢子。

3.3 柞蠶集團(tuán)母蛾鏡檢是微粒子病檢驗檢疫技術(shù)發(fā)展的必然趨勢,本次集團(tuán)母蛾檢驗試驗過程中發(fā)現(xiàn):與傳統(tǒng)的顯微鏡母蛾檢查相比,樣品制作要求蘸取沉淀的量要適當(dāng),且要一個樣品制作多個片子,逐漸稀釋脂肪利于觀察;顯微鏡檢查時觀測的視野數(shù)量要多,細(xì)致程度要高,至少觀察10個視野,不能一帶而過。這一點(diǎn)與家蠶集團(tuán)母蛾鏡檢的要求相一致[5]。

3.4 家蠶集團(tuán)檢驗中為提高檢出率,磨蛾通常使用0.5%K2CO3作為研磨液[6],秦利等指出在卵及蟻蠶整體取樣檢驗時,可加入1%KOH或NaOH研磨[7]制成臨時標(biāo)本進(jìn)行檢查。生產(chǎn)中柞蠶集團(tuán)研磨是否應(yīng)使用堿液作為研磨液,以及使用的濃度和方法,今后還需要進(jìn)一步試驗。