王 敬 李 立 劉備備 王 暉 王 鵬 楊貴明 宋永學(xué)*

(1.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所/ 2.河北省高校特色蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北承德 067000;3.承德醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,河北承德 067000;4.天津脈絡(luò)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司,天津 30038;5.承德應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院,河北承德 067000)

桑黃是銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)一類真菌的統(tǒng)稱,包括許多個(gè)種,藥用價(jià)值極高[1]。其中粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)是桑黃類群的一個(gè)種,其子實(shí)體符合本草古籍中記載的桑黃特征,寄生于桑、柳等闊葉樹的樹干上,子實(shí)體為一年生,革質(zhì)至軟木栓質(zhì),干后木栓質(zhì),側(cè)生無柄,菌蓋平展呈半圓形,表面黃色至暗褐色,被粗毛,無環(huán)帶,下生菌孔。分布于華北、東北、西北等地。桑黃作為中藥使用已有兩千多年的歷史,《神農(nóng)本草經(jīng)》《藥性論》《本草綱目》等許多中醫(yī)古籍中均有記載?！侗静輬D經(jīng)》云:“桑耳—名桑黃,有黃熟陳白者,又有金色者,皆可用”[2]。并附有“信州桑黃”圖一幅,圖中桑黃上有毛,符合粗毛纖孔菌特征。桑黃具有活血、化飲,止瀉等功效,常用于血崩,血淋,脫肛、瀉血等的治療。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桑黃中所含有的多糖[3]、黃酮[4]、萜類[5]等多種活性成分具有很好的抗腫瘤[6]、降血糖[7]、提高免疫力等功效[8]。

遺傳密碼子是連接蛋白質(zhì)和DNA的信息橋梁[9]。人體所存在的氨基酸中絕大多數(shù)的氨基酸往往對應(yīng)著幾種不同編碼的密碼子。這種編碼同一種氨基酸的不同密碼子就被稱之為同義密碼子。然而對于編碼同一種氨基酸的密碼子來說,生物體對于選擇哪種密碼子并不是隨機(jī)的,而是有著自身的選擇偏好性,且這種偏好性在不同的物種之間,甚至是同一物種的不同部位也有著很大的區(qū)別。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),選擇最優(yōu)密碼子可使相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加[10]。同時(shí),通過篩選最優(yōu)密碼子可提高生物的外源基因表達(dá)量[11]。

本研究通過對粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子使用的偏好性進(jìn)行研究,揭示其密碼子的使用規(guī)律,并與4種生物的密碼子使用偏好性進(jìn)行對比,為提高粗毛纖孔菌基因的表達(dá)及選擇合適的異源表達(dá)宿主提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及編碼序列的篩選

用承德地區(qū)野生粗毛纖孔菌桑黃子實(shí)體提取菌種后,進(jìn)行人工栽培,接種栽培菌包后于室內(nèi)避光恒溫28 ℃培養(yǎng)。30天后菌絲長滿菌包,轉(zhuǎn)入溫室大棚培養(yǎng)18 d(散射光小于1 000 Lx,20～32 ℃),在出子實(shí)體之前,在每個(gè)菌包的同樣位置挖取菌絲組織,液氮速凍,-80 ℃保存。將所需的材料送檢至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行測序工作。測序工作完成后對編碼序列進(jìn)行篩選:使用perl語言選取長度≥300 bp且以ATG為起始密碼子,TAG、TGA、TAA為終止密碼子的完整的編碼序列,并將重復(fù)的序列刪除,最終的得到所需的編碼序列[12]。

1.2 密碼子堿基組成分析

使用CodonW軟件計(jì)算粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼序列GC的含量、有效密碼子數(shù)(ENC)、密碼子中第3位堿基的GC含量(GC3s)和相對同義密碼子相對使頻率(RSCU)等。使用Python對GC12(GC1與GC2的平均值)的值進(jìn)行計(jì)算[13]。

1.3 中性繪圖分析

中性繪圖:以GC3s的值為橫坐標(biāo)、GC12的值為縱坐標(biāo)。當(dāng)GC12和GC3s相關(guān)且二者回歸線斜率趨近1時(shí)表明突變是影響密碼子偏好性的主因。反之,則是由自然選擇導(dǎo)致的密碼子偏好性[14]。

1.4 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot繪圖:以GC3s作為橫坐標(biāo),ENC值作為縱坐標(biāo)作圖,公式為:ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2]。ENC的值在20～61的范圍之間,當(dāng)ENC的值越大說明密碼子的偏好性越弱,反之則說明密碼子的偏好性越強(qiáng)[15]。

1.5 PR2-Bias plot偏倚分析

PR2-Bias plot:以GC[G3/(G3+C3)]的值為橫坐標(biāo),AT[A3/(A3+T3)]的值為縱坐標(biāo)作圖。若基因不受突變壓力或自然選擇的影響時(shí)T=A,C=G。但實(shí)際上由于生物體收到外界環(huán)境的影響導(dǎo)致基因突變、選擇壓力等的作用是會導(dǎo)致G、C的數(shù)量變化[16]。

1.6 最優(yōu)密碼子的篩選

RSCU值指的是編碼某一氨基酸的密碼子與能夠編碼這個(gè)氨基酸的所有密碼子的比值。當(dāng)RSCU的值大于1時(shí)表明密碼子使的偏好性較大。將ENC的由小到大依次排列,選取最小值的10%和最高值的10%的編碼序列分別建成高表達(dá)庫和低表達(dá)庫,并計(jì)算出兩個(gè)表達(dá)庫的RSCU值,兩個(gè)表達(dá)庫的差即為ΔRSCU。當(dāng)ΔRSCU的值大于等于0.08的密碼子即為最優(yōu)密碼子。

1.7 粗毛纖孔菌與模式生物之間的密碼子偏好性比較

在Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)網(wǎng)站上下載庫德里阿茲威酵母、家蠶、擬南芥和大腸桿菌的密碼子使用頻率,并與粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼基因密碼子使用頻率進(jìn)行比較。

1.8 數(shù)據(jù)作圖

使用Origin 2023b作圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毛纖孔菌GC含量的分析

通過使用Perl語言對粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,共篩選出符合條件的10 716條CDS序列。對篩選出的10 716條CDS序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼基因的總GC含量在31.6%～71%,并主要分布在50%～55%之間;粗毛纖孔菌的平均總GC的含量為51.7%。這說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子偏向于使用G、C堿基(結(jié)果如圖1A所示),但偏好性不是很強(qiáng)。GC3s的總含量在25.6%～90.4%之間,GC3s的總平均含量為50.8%且大部分的基因分布在50% ～60%之間,說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組基因的末位更偏向于使用G、C為結(jié)尾的堿基(結(jié)果如1圖B所示)。

圖1 粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組GC和GC3s含量的柱狀圖

2.2 粗毛纖孔菌的中性繪圖分析

由粗毛纖孔菌的中性繪圖分析結(jié)果顯示GC12的含量范圍為33.8%～73.0%,大部分的基因樣本分布在回歸線(y=-0.13667x+57.84914)的兩側(cè),GC12與GC3的關(guān)系為負(fù)相關(guān),且相關(guān)性系數(shù)為-0.13667,R2為0.04005(結(jié)果如圖2所示),GC12與GC3的相關(guān)性較弱,說明密碼子1、2位上的堿基與3位的堿基基本無關(guān)聯(lián)性,即粗毛纖孔菌密碼子使用的偏好性受自然環(huán)境影響最大。

圖2 粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組GC12和GC3含量的中性繪圖分析

2.3 粗毛纖孔菌的ENC-plot繪圖分析

粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組ENC的范圍是27.98～61,平均值是59.41。根據(jù)ENC=35為密碼子偏好性強(qiáng)弱的分界值,粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組基因的編碼序列中有24條(占比為0.22%)這部分基因在密碼子的使用上具有比較強(qiáng)的偏好性;ENC值為61的編碼序列有1852條(占比為17.3%),這部分基因在密碼子的使用上無偏好性。通過ENC-plot的圖示觀察發(fā)現(xiàn),基因沒有均勻的分布在期望曲線的兩邊(圖3所示)。

圖3 ENC-GC3s相關(guān)性分析

綜合上述分析,受選擇壓力的作用,粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子的偏好性較低,但在不同的基因中密碼子使用的偏好性有一定程度上的差異,通過公式:ENC比值=(ENC期望值-ENC觀測值)/ENC得出表1的數(shù)據(jù)。

表1 ENC比值分布

由表1可以看出,比值主要集中在-0.1～ 0.2之間,為總基因的88.4%,ENC期望值和觀測值之間的差異較小,說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子的偏好性主要受突變壓力和自然選擇的影響。

2.4 PR2-Bias plot 分析

根據(jù)偏倚性分析,粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組基因的平均分布位置為(0.4915,0.4824),從圖4可以看出大部分轉(zhuǎn)錄組基因都分布在中心位置的附近,少部分的基因相對于中心有一定程度上的偏離。這進(jìn)一步說明了粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組基因密碼子使用的偏好性主要來源于突變壓力產(chǎn)生的影響。

圖4 A3/(A3 + T3)與G3/(G3 + C3)的偏倚性分析

2.5 粗毛纖孔菌同義密碼子的使用頻率及最優(yōu)密碼子分析

RSCU值指的是編碼某一氨基酸的密碼子與能夠編碼這個(gè)氨基酸的所有密碼子的比值。當(dāng)RSCU的值大于1時(shí)表明密碼子使用的偏好性較大,說明編碼某一氨基酸的密碼子使用偏好性較強(qiáng);當(dāng)RSCU值小于1時(shí)說明密碼子的使用偏好性較弱;當(dāng)RSCU的值等于1時(shí)說明密碼子無使用偏好性。

從表2中可以看出:RSCU>1的密碼子有35個(gè),且在這些密碼子中,第三位置的堿基以A結(jié)尾的有7個(gè);以U為結(jié)尾的有10個(gè);以C為結(jié)尾的有9個(gè);以G為結(jié)尾的有9個(gè)。說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子在同義密碼子使用頻率中在第三位密碼子的選擇上無大的差別。

粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組最優(yōu)密碼子的個(gè)數(shù)為14,分別為UUC、UCC、UAC、UGC、CUU、CUC、CGC、AUC、ACG、AAC、AAG、GUC、GCG、GAG,且在最優(yōu)密碼子中第三位堿基中C、U、G的數(shù)量分別為9、1、4。這說明在最優(yōu)密碼子的選擇上,粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組在堿基第三的位置上更為傾向于使用C和G 。

2.6 密碼子使用頻率的比較

不同物種之間對于密碼子使用的偏好性不同,因此,研究不同物種間在密碼子使用上的偏好性差異有利于提高目標(biāo)基因在進(jìn)行外源表達(dá)時(shí)的效率。當(dāng)兩個(gè)物種在同一密碼子使用頻率上的比值≤0.5或≥2.0,說明它們在使用同一密碼子時(shí)的偏好性較大,反之則說明在密碼子的使用上差異較小。

粗毛纖孔菌與庫德里阿茲威酵母、家蠶、擬南芥和大腸桿菌密碼子使用頻率的比較如圖5所示。粗毛纖孔菌與這四種生物之間密碼子使用的偏好性有著不同程度上差異:與庫德里阿茲威酵母密碼子使用頻率的比值結(jié)果中,大于等于2的密碼子為3種,小于等于0.5的密碼子為59種;與家蠶密碼子使用頻率的比值結(jié)果中,大于等于2的密碼子為0種,小于等于0.5的密碼子為58種;與擬南芥密碼子使用頻率的比值結(jié)果中,大于等于2的密碼子為1種,小于等于0.5的密碼子為61種;與大腸桿菌密碼子使用頻率的比值結(jié)果中,大于等于2的密碼子為1種,小于等于0.5的密碼子為60種。這說明粗毛纖孔菌與這幾種生物在密碼子使用偏好性上均有很大程度上的差異性。

圖5 粗毛纖孔菌與其他物種密碼子偏好性的成對比較

3 討 論

生物在自然選擇條件下不斷進(jìn)化,最終形成了一套自己所特有密碼子的使用模式,而這種模式在不同種物種之間,甚至是在自身的不同器官中差異往往也是不同的[17]。研究密碼子使用的偏好性可以為后續(xù)研究提供一定程度上的應(yīng)用價(jià)值,例如可以提高異源基因的表達(dá)效率、預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能、解析生物體的進(jìn)化規(guī)律等[18-19]。本研究以粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組中的10 716條編碼基因?yàn)檠芯繉ο?通過使用CodonW軟件和perl語言對它的密碼子使用偏好性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼基因的總GC含量在31.6%～71%之間,平均值為51.7%,GC3s含量在25.6%～90.4%之間,平均值為50.8%。從這些數(shù)據(jù)中可以看出GC3s的含量范圍要大于總GC的含量范圍,表明GC3s的含量不集中,且粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子和末尾堿基偏向于使用G、C堿基,但偏好性不是很強(qiáng)。粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組ENC值的范圍是27.98～ 61,平均值59.41高于35,且轉(zhuǎn)錄組編碼序列ENC值大于35的占97.8%,說明粗毛纖孔菌密碼子在使用時(shí)偏好性較弱。這與對馬尾松[20]、橄欖[21]的研究結(jié)果一致。偏倚性分析的結(jié)果顯示大部分的基因分布于中心的周圍,少部分基因偏離中心,說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性主要來源于突變壓力對其產(chǎn)生的影響。粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼基因的ENC值與ENC期望值的差別不大,說明粗毛纖孔菌在密碼子使用偏好性上是受突變壓力和自然選擇等多重因素的影響,這和大黃[22]轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好性的研究一致。

粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組的編碼基因中,RSCU>1的密碼子有35個(gè),且在這些密碼子中,第三位置的堿基以A結(jié)尾的有7個(gè);以U為結(jié)尾的有10個(gè);以C為結(jié)尾的有9個(gè);以G為結(jié)尾的有9個(gè)。說明粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組密碼子在同義密碼子的使用頻率中在第三位密碼子的選擇上無大差別,但在最優(yōu)密碼子的使用上在堿基第三的位置上更為傾向于使用C和G。粗毛纖孔菌與庫德里阿茲威酵母、家蠶、擬南芥和大腸桿菌密碼子使用頻率差異較大,這說明粗毛纖孔菌與這幾種生物在密碼子使用偏好性上均有很大程度上的差異性[23],因此,若選擇粗毛纖孔菌進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)應(yīng)避開這幾種生物作為外源表達(dá)體。

本研究通過對粗毛纖孔菌轉(zhuǎn)錄組編碼序列密碼子進(jìn)行偏好性分析并探討導(dǎo)致密碼子偏好性的影響因素。結(jié)果顯示粗毛纖孔菌密碼子使用的偏好性比較弱,說明突變壓力和自然選擇為影響密碼子使用偏好性的主要原因。通過對粗毛纖孔菌密碼子偏好性的分析,從中篩選出14個(gè)最優(yōu)密碼子,可為粗毛纖孔菌桑黃在基因工程、遺傳機(jī)理及在其他生物體中進(jìn)行異源表達(dá)提供一些參考價(jià)值及理論基礎(chǔ)。