常 悅,張玉立,鄭晗雪,盧夢瑤,吳沅臻,李達潔,楊 歡*,胡建慧
(1.如皋市人民醫(yī)院藥劑科,江蘇 如皋 226500; 2.南通大學附屬如皋醫(yī)院藥劑科,江蘇 如皋 226500;3.江蘇大學藥學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 4.南京中醫(yī)藥大學附屬鎮(zhèn)江醫(yī)院檢驗科,江蘇 鎮(zhèn)江 212003)
小兒復方雞內(nèi)金散具有健脾開胃,消食化積的功效,主治小兒因脾胃不和引起的食積脹滿、飲食停滯等[1],據(jù)報道其治療小兒厭食的總有效率達96.15%[2]。該方由雞內(nèi)金、六神曲以及淀粉和蔗糖制備而成,2020 年版《中國藥典》 規(guī)定雞內(nèi)金來源為家雞GallusgallusdomesticusBrisson 的干燥沙囊內(nèi)壁[3],主要偽品為鴨內(nèi)金(來源于麻鴨Anasplatyrhynchos) 和鵝內(nèi)金(來源于家鵝Anseranser),具有與雞內(nèi)金較相似的形態(tài)特征[4],然而藥典中對雞內(nèi)金的質量評價主要依賴于性狀鑒別,缺乏專屬性更強的質量控制方法。此外,雞內(nèi)金中主要成分為蛋白質、多糖等[5-8],植物源中藥常用的小分子檢測技術難以發(fā)揮作用。
目前的動物藥鑒別方法主要基于蛋白質和DNA,一些基于色譜和質譜的技術亦被開發(fā)用于動物藥的鑒定,但操作復雜,設備昂貴[9-10]。近幾十年來,基于聚合酶鏈反應(PCR) 的技術已逐步成為動物藥鑒定的核心方法,在便利性等方面具有突出優(yōu)勢[11-16]。中成藥由飲片粉碎或提取后制成,難以通過性狀鑒別等鑒定所含成分。多重PCR 技術可在混合DNA 中同時分析多個物種,且無需昂貴設備和特殊試劑[17-20]。本文研究建立了三重PCR 技術以鑒定小兒復方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的真?zhèn)巍?/p>
1.1 儀器 AE240 型電子天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司); TP-02W-0043 型恒溫金屬浴(寧波拓普森科學儀器有限公司); UPT-I-5T 型純水機(南京優(yōu)普環(huán)保設備有限公司); ND-1000 Nanodrop 型核酸蛋白分析儀(美國Thermo Fisher Scientific 公司); T100 型PCR 儀、Basic 型電泳電源、Gel Doc EZ 型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);TGL-16C 型臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)。
1.2 試劑 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、氯化鈉、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、甲醇、三氯甲烷、無水乙醇、異戊醇、異丙醇、鹽酸(36.0~38.0%) 為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司; Tris-平衡酚(生物級)購自北京索萊寶科技有限公司; 10 mmol/L dNTP Mix(PCR 級)、DreamTaqTMGreen DNA Polymerase (生物級)均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司; 三羥甲基氨基甲烷(Tris,分子生物級,純度99.9%) 購自德國BioFroxx GmbH 公司; Low DNA Marker (生物級) 購自武漢永璨生物科技有限公司; 瓊脂糖(Low EEO,生物級) 購自上海碧云天生物技術有限公司; 溴化乙錠(EB,生物級,純度≥95.0%)、Proteinase K (生物級) 購自美國Sigma-Aldrich 公司。
1.3 藥材 2019 年從國內(nèi)多地市場采集家雞、麻鴨、家鵝干燥胃內(nèi)膜15 批,信息見表1,經(jīng)鎮(zhèn)江市中醫(yī)院孫小祥主任中藥師鑒定為正品。通過COI 條形碼或已發(fā)表文獻特異性引物進行了驗證,發(fā)現(xiàn)NCBI 比對同源性均≥97%。從8 個廠家采購小兒復方雞內(nèi)金散,具體信息見表2,性狀見圖1。
圖1 小兒復方雞內(nèi)金散性狀
表1 胃內(nèi)膜基原信息
表2 小兒復方雞內(nèi)金散信息
2.1 小兒復方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑制備
2.1.1 小兒復方雞內(nèi)金散 組方飲片雞內(nèi)金(34 g,自制)、六神曲(66 g,江蘇蘇州市天靈中藥飲片有限公司,批號180904)。根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》(中藥成方制劑第十四冊) 制備,具體制法為2 味飲片分別粉碎成細粉,加白砂糖40 g、淀粉60 g,混勻,過篩,即得。
2.1.2 偽品 將雞內(nèi)金更換為鴨內(nèi)金或鵝內(nèi)金,按“2.1.1” 項下方法制備,即得。
2.1.3 陰性制劑 不加入雞內(nèi)金,按“2.1.1” 項下方法制備,即得。
2.2 DNA 提取 參考文獻[14] 報道,稱取“2.1” 項下小兒復方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑各50.0 mg,采用甲醇預沉淀結合CTAB 法提取DNA,酚仿抽提法進行純化,離心管內(nèi)殘留物以25 μL TE 緩沖液溶解,制得DNA 供試品溶液,-20 ℃保存。
2.3 特異性引物設計與合成 參考文獻[4] 報道,從GenBank 數(shù)據(jù)庫中搜索并下載家雞、麻鴨、家鵝3 個物種的線粒體基因序列(登記號NC_001323.1、NC_009684.1、NC_011196.1),并采用Oligo 軟件(v.7.60) 設計物種特異性引物,由DNAMAN (v.8.0.8.789) 軟件進行差異評估,由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成,-20 ℃保存,引物序列見表3。
表3 特異性引物序列
2.4 PCR 反應條件優(yōu)化 PCR 反應體系為10×PCR 緩沖液(2.5 μL)、2.0 mmol/L MgCl2(2.5 μL)、0.2 mmol/L dNTPs (0.5 μL)、引物各0.5 μL、0.625 U Taq 聚合酶、10 ng/μL DNA 模板1 μL、蒸餾水補足至25 μL,其中引物濃度對反應結果影響較大,對引物組合濃度進行優(yōu)化,具體見表4。PCR 擴增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離,溴化乙錠染色后凝膠電泳成像儀紫外照射觀察。
表4 引物濃度優(yōu)化方案
PCR 反應條件[4]為95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃終延伸5 min,擴增產(chǎn)物在2% 瓊脂糖凝膠電泳中進行分離,溴化乙錠(EB)染色后凝膠電泳成像儀紫外照射觀察。為了考察反應條件,在最優(yōu)引物組合下使用不同的自制小兒復方雞內(nèi)金散DNA模板,在33~35 次范圍內(nèi)對PCR 循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化。
2.5 特異性試驗 按“2.1” 項下方法制備小兒復方雞內(nèi)金散及其偽品、陰性制劑各10 批,采用三重PCR 法擴增,考察方法特異性。
2.6 靈敏度試驗 以10 倍法依次稀釋小兒復方雞內(nèi)金散及其偽品的DNA 供試品溶液,在“2.4” 項反應條件下進行擴增。
2.7 雞內(nèi)金檢測 采用三重PCR 法,對來自8 個廠家的11 批小兒復方雞內(nèi)金散進行真?zhèn)舞b定。
3.1 PCR 反應條件 PCR 擴增反應體系的引物濃度優(yōu)化結果見圖2,從中選擇條帶亮度均勻、非特異性條帶弱的引物組合(H) 進行后續(xù)反應條件的優(yōu)化。
圖2 引物濃度優(yōu)化多重PCR 條帶圖
循環(huán)數(shù)優(yōu)化結果見圖3。由此可知,33 次循環(huán)得到的條帶清晰,無明顯非特異性條帶產(chǎn)生,而鴨內(nèi)金替代的偽品制劑DNA 樣品在34 次循環(huán)(泳道7)、35 次循環(huán)(泳道3) 后均在約155 bp 處觀察到了非特異性擴增條帶。
圖3 循環(huán)數(shù)優(yōu)化多重PCR 條帶圖
3.2 特異性試驗 由圖4 可知,陽性制劑經(jīng)引物擴增后僅出現(xiàn)雞內(nèi)金清晰的單一條帶,偽品制劑出現(xiàn)相應位置的替代品條帶,而陰性制劑沒有出現(xiàn)條帶,表明該方法特異性良好。
3.3 靈敏度試驗 由圖5 可知,在0.1 ng/μL 質量濃度下亮度均較弱,而進一步降低至0.01 ng/μL 時無法觀察到條帶,故三重特異性引物PCR 方法的檢測限為0.1 ng/μL。
圖5 靈敏度試驗多重PCR 條帶圖
3.4 真?zhèn)舞b定 由圖6、表5 可知,9 批樣品只檢測出家雞DNA,鑒定為正品; 另外2 批在檢測出家雞DNA 的同時還檢出麻鴨DNA,鑒定為摻偽品,檢出率為18.2%。
圖6 真?zhèn)舞b定多重PCR 條帶圖
準確鑒別動物基原是保障動物藥用藥安全與有效的先決條件,但正品與偽品形態(tài)特征相似和從業(yè)人員缺乏專業(yè)經(jīng)驗,使得性狀鑒別難以區(qū)分正、偽品。本研究鑒于雞內(nèi)金的偽品、摻偽品較多,而傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別難以發(fā)揮作用的現(xiàn)狀,對其分子鑒別方法展開研究。
以DNA 分子為目標的方法包括常規(guī)PCR、熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR、隨機擴增多態(tài)性DNA 分析、長度多態(tài)性分析等。其中常規(guī)PCR 具有簡便、準確、靈敏等優(yōu)點,更適合中藥鑒定實踐,應用最廣泛,因此本研究基于該技術建立小兒復方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的關鍵鑒定手段。
本研究基于雞內(nèi)金正品與偽品線粒體基因序列差異,分別設計特異性引物,通過多重PCR 技術鑒定小兒復方雞內(nèi)金散中雞內(nèi)金的真?zhèn)?,?yōu)化了PCR 方法的反應體系、反應條件,并考察了所建立方法的靈敏度和特異性,為其質量標準的修訂提供科學依據(jù)。結果表明,當退火溫度為60 ℃,引物組合(PGD ∶PAP ∶PAA) 濃度為0.28 μmol/L ∶0.16 μmol/L ∶0.08 μmol/L,循環(huán)數(shù)為33 次時,擴增反應特異性良好,引物間無交叉反應,檢測限均為0.1 ng/μL。PCR 技術在中藥鑒定中發(fā)揮著重要作用,主要難點是對炮制品、中成藥中含量較低的成分進行準確鑒定,后續(xù)可對DNA 提取方法等進行優(yōu)化,進一步提高靈敏度。
本研究所建立的鑒定技術在同一反應體系中進行,較為便捷,并從小兒復方雞內(nèi)金散中檢出了鴨內(nèi)金,取得了較好的效果。但中成藥中動物藥的種類、含量差異很大,背景干擾亦有所不同,因而PCR 反應的體系和條件需根據(jù)具體情況作出適當?shù)恼{(diào)整與優(yōu)化,以便于更好地監(jiān)控中成藥的質量。