李艷霞，李益萍，王肖龍

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，我國(guó)心腦血管疾病患病率及死亡率仍處于上升階段，心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上［1］。盡管人們一直在努力改善動(dòng)脈粥樣硬化的臨床治療，但對(duì)其治療的巨大需求仍未得到滿足。無論遵循何種治療方案，20%的患者在首次臨床表現(xiàn)出現(xiàn)后的三年內(nèi)都會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)性心肌梗死［2］。研究表明，中醫(yī)藥具有一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，并因其作用靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)［3-4］。

盾葉冠心寧片為薯蕷根莖提取制成的膏片，具有活血化瘀、行氣止痛、養(yǎng)血安神的功效。臨床研究表明盾葉冠心寧片治療動(dòng)脈粥樣硬化效果顯著，可改善臨床心絞痛、急性缺血性腦卒中癥狀，還具有調(diào)節(jié)血脂異常及降低同型半胱氨酸水平的作用［5］。近期發(fā)現(xiàn)，多種非編碼RNA，如微小RNA （microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 在動(dòng)脈粥樣硬化病理生理過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，可影響細(xì)胞的活化、增殖、脂質(zhì)代謝和炎性因子分泌等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其已經(jīng)成為疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究常用技術(shù)手段之一。利用其信息量大、指標(biāo)客觀而又層次深、同時(shí)具有網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)性的特點(diǎn)，可以從多角度深入挖掘盾葉冠心寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的本質(zhì)。本研究觀察盾葉冠心寧片對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，同時(shí)利用高通量全基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并篩選其中的關(guān)鍵通路。

1 材料與方法

1.1 盾葉冠心寧片抗ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用

1.1.1 動(dòng)物 40 只8 周齡SPF 級(jí)ApoE-/-雄性小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2016-0011］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境干燥、通風(fēng)，溫度20 ～26 ℃，相對(duì)濕度40% ～70%，自由獲取水和食物。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （倫理號(hào)PZSHUTCM18113010），并嚴(yán)格遵守動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

1.1.2 高脂飼料配方 高脂飼料由78.8%繁殖鼠料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%膽鹽組成，購(gòu)于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司［生產(chǎn)許可證號(hào)蘇飼證（2014） 01008］。

1.1.3 試劑與藥物 蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE） 染色劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所； 油紅O 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司； 馬松（Masson） 染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司； 異丙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。瑞舒伐他汀鈣片［可定，阿斯利康藥業(yè)（中國(guó)） 有限公司，規(guī)格10 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20160547］； 盾葉冠心寧片（江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020309，0.16 g/片）。

1.1.4 分組、造模及給藥 將40 只ApoE-/-雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、可定組、盾葉組?？瞻捉M予以基礎(chǔ)飼料，其余各組予以高脂飼料，造模的同時(shí)可定組、盾葉組按人-動(dòng)物藥物劑量換算表分別灌胃給予相應(yīng)可定片0.76 mg/kg、盾葉冠心寧片146 mg/kg，空白組、模型組分別灌胃給予等量蒸餾水。

1.1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè) 連續(xù)喂養(yǎng)12 周后取材，各組小鼠禁食不禁水12 h。眼底靜脈叢取血，靜置2 h 以上，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠脫頸椎處死后固定，剪開腹腔，移除腹腔內(nèi)臟器，暴露腹主動(dòng)脈，再剪開胸腔，暴露整個(gè)腹腔與胸腔，沿著腹主動(dòng)脈向上分離直至心臟，向下分離直至髂總動(dòng)脈分叉處，保留主動(dòng)脈及心臟。每組取10 只小鼠心臟用OCT 包埋，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。將主動(dòng)脈經(jīng)石蠟包埋切片后按試劑盒說明書分別進(jìn)行HE 染色、油紅O 染色、Masson 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件分析HE 染色病變面積與整個(gè)管腔面積的比值； 油紅O 染色著色區(qū)的病變面積占比； Masson染色膠原纖維面積占比。

1.2 生物信息分析 對(duì)空白組、模型組、盾葉組小鼠主動(dòng)脈組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，數(shù)據(jù)包含各個(gè)樣本的lncRNA、mRNA、miRNA 測(cè)序結(jié)果。數(shù)據(jù)經(jīng)過Illumina CASAVA Version 2.20 軟件［6］、Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcript Version 0.1.6 軟件［7］、cufflinks Version 2.2.1 軟件［8］處理后，用Cuffcompare 和已知的基因模型進(jìn)行比較，得到每個(gè)樣本中編碼基因的表達(dá)。

1.2.1 差異表達(dá)RNAs 的篩選 采用R3.4.1 中的limma（Version 3.32.5）［9］篩選每個(gè)組間差異表達(dá)RNAs，設(shè)定為FDR 值＜0.05 且|log2FC|＞1，對(duì)篩選出的組間差異表達(dá)RNAs 進(jìn)行基于DAVID6.8 在線分析工具的GO 生物學(xué)過程和KEGG 通路的富集分析，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.2.2 構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 首先用miRanda 本地化工具［10］對(duì)lncRNA-miRNA 的結(jié)合關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，miRanda 比對(duì)參數(shù)設(shè)置為Gap Open Penalty ＝-8，Gap Extend＝-2，Score Threshold ＝80%，Energy Threshold ＝-20，同時(shí)計(jì)算目標(biāo)lncRNA-miRNA 表達(dá)相關(guān)性系數(shù)，并只保留呈負(fù)相關(guān)的作用對(duì)，以此構(gòu)建lncRNA-miRNA 網(wǎng)絡(luò)，然后再利用starBase Version 2.0 數(shù)據(jù)庫［11］對(duì)目標(biāo)miRNAs所調(diào)控的靶基因進(jìn)行搜索同時(shí)計(jì)算目標(biāo)miRNA-mRNA 表達(dá)相關(guān)性系數(shù)，并只保留負(fù)相關(guān)的作用對(duì)，構(gòu)建miRNAmRNA 調(diào)控關(guān)系連接，最后采用R3.4.1 語言中的cor.test函數(shù)計(jì)算lncRNA-mRNA 之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC），保留高于0.9 的作用對(duì)，構(gòu)建lncRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)。對(duì)上述lncRNA-miRNA、miRNAmRNA、lncRNA-mRNA 連接關(guān)系進(jìn)行綜合整理，最終構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行GO 生物學(xué)過程和KEGG 通路的富集分析。

1.2.3 WGCNA 及STEM 分析重疊基因 首先運(yùn)用WGCNA分析得到與疾病狀態(tài)顯著相關(guān)模塊所包含的RNAs 其次利用STEM 分析，得到顯著的表達(dá)模式變化聚類包含的RNAs，最后將上述2 種分析方法得到的重疊RNAs 進(jìn)行GO生物學(xué)過程和KEGG 通路富集分析。

權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法 （weighed gene coexpression network analysis，WGCNA） 是一種構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的典型系統(tǒng)生物學(xué)算法。為了符合無尺度網(wǎng)絡(luò)分布，首先需要確定加權(quán)系數(shù)power，即R2≥0.8 時(shí)的加權(quán)系數(shù)。利用R3.4.1 中的WGCNA 包Version 1.61［12］對(duì)目標(biāo)RNAs并集集合進(jìn)行分析，得到與疾病狀態(tài)顯著相關(guān)的模塊及其中包含的RNAs。

利用STEM［13］軟件對(duì)空白組、模型組、盾葉組表達(dá)模式顯著相似性聚類。以相似性閾值0.8，顯著性閾值P＜0.05，篩選得到集合中包含的RNAs。最后對(duì)2 種方法篩選出來的重疊基因進(jìn)行GO 生物學(xué)過程和KEGG 通路的富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以（±s） 表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 盾葉冠心寧片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇病理學(xué)的影響 HE 染色顯示，與空白組比較，模型組主動(dòng)脈竇處的病變面積增加（P＜0.05），提示造模成功； 與模型組比較，可定組、盾葉組主動(dòng)脈竇處的病變面積減少（P＜0.05），但盾葉組抗主動(dòng)脈竇斑塊面積效果不如可定組（P＜0.05），見圖1。

油紅O 染色顯示，空白組主動(dòng)脈竇處僅見少量脂質(zhì)蓄積； 與空白組比較，模型組主動(dòng)脈竇處的脂質(zhì)蓄積增加（P＜0.05）； 與模型組比較，可定組、盾葉組主動(dòng)脈竇處的脂質(zhì)蓄積減少，油紅O 染色面積降低（P＜0.05），盾葉組與可定組無差異（P＞0.05），見圖1。

膠原纖維的水平與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。Masson 染色顯示，與空白組比較，模型組主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)膠原纖維減少（P＜0.05）； 與模型組比較，盾葉組主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)膠原纖維增加（P＜0.05），見圖1。

2.2 差異表達(dá)RNAs 通過高通量測(cè)序?qū)? 例ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織樣本的進(jìn)行測(cè)序。得到363 個(gè)miRNAs、15 513個(gè)lncRNAs 和11 162 個(gè)mRNAs。經(jīng)比對(duì)共發(fā)現(xiàn)1 623 個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中與空白組比較，模型組共有602 個(gè)RNAs 表達(dá)下調(diào)，593 個(gè)RNAs 表達(dá)上調(diào)，總計(jì)1 195 個(gè)差異基因，分別為441 個(gè)lncRNAs、33 個(gè)miRNAs、721 個(gè)mRNAs。與模型組比較，盾葉組共有131 個(gè)RNAs 表達(dá)下調(diào)，391 個(gè)RNAs 表達(dá)上調(diào)，總計(jì)522 個(gè)差異基因，分別為275 個(gè)lncRNAs、3 個(gè)miRNAs、244 個(gè)mRNAs，見表1～2。

表1 差異表達(dá)RNAs 個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)（個(gè)）

表2 差異表達(dá)RNAs 類型個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)（個(gè)）

為驗(yàn)證差異表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將全部1 623 個(gè)差異基因的表達(dá)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示不同組別的樣本能完全區(qū)分開，見圖2A。對(duì)組間差異表達(dá)的RNAs 進(jìn)行GO 功能和KEGG 分析，可知模型組與空白組顯著差異表達(dá)基因可富集到脂肪酸代謝（P＜0.001）、有機(jī)酸合成（P＜0.001）、PPAR 信號(hào)通路（P＜0.001） 等信號(hào)通路； 盾葉組與模型組顯著差異表達(dá)基因可富集到與細(xì)胞外基質(zhì)組織 （P＜0.001）、細(xì)胞骨架組織（P＜0.001）、血管平滑肌收縮（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信號(hào)通路，見圖2B。

2.3 構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過miRanda 本地化工具、starBase 資源及cor.test 函數(shù)計(jì)算對(duì)lncRNA、miRNA 和mRNA 之間的關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，共篩選得到96 對(duì)lncRNA-miRNA 連接、88 對(duì)miRNA-mRNA 連接、1 304對(duì)lncRNA-mRNA 連接，對(duì)連接關(guān)系進(jìn)行整理并構(gòu)建成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，見圖3A。通過GO 功能和KEGG 分析可知，共表達(dá)部分可分別富集到轉(zhuǎn)錄調(diào)控（P＜0.001）、RNA 代謝過程的正調(diào)控（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信號(hào)通路，見圖3B。

2.4 WGCNA 及STEM 分析重疊基因 首先運(yùn)用WGCNA 分析，為使網(wǎng)絡(luò)接近無尺度分布，計(jì)算參數(shù)power 取值為1～30R2。如果模型R2越接近1，則模型越符合無尺度分布，一般情況下應(yīng)R2≥0.8，本研究以0.9 為標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)power＝24 時(shí)R2首次達(dá)到0.9，見圖4A。剪枝高度設(shè)定為cutHeight ＝0.995，共篩選得到9 個(gè)相關(guān)模塊，見圖4B。計(jì)算每個(gè)模塊與不同狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性，共發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)與樣本狀態(tài)顯著正相關(guān)的模塊，分別為green、blue、pink 和red，見圖4C，其中g(shù)reen 包含124 個(gè)RNAs，blue 包含138 個(gè)RNAs，pink 包含93 個(gè)RNAs，red 包含123 個(gè)RNAs，總計(jì)478 個(gè)RNAs。

圖4 WGCNA 分析圖

其次利用STEM 對(duì)之前的1 623 個(gè)并集RNAs 進(jìn)行表達(dá)變化趨勢(shì)聚類，共得到了2 個(gè)顯著的表達(dá)模式變化聚類，Cluster 1、2 分別包含了496、341 個(gè)RNAs （圖5）。

圖5 STEM 表達(dá)譜分析聚類圖

最后比較WGCNA 算法獲得的478 個(gè)RNAs 和STEM 分析中cluster 1、2 中包含的RNAs，分別有36、120 個(gè)重疊RNAs，見圖6A。通過GO 功能和KEGG 分析可知，以上重疊RNAs 可分別富集到PPAR 信號(hào)通路（P＜0.001），脂質(zhì)生物合成過程（P＜0.001），脂肪酸代謝過程（P＜0.001）等信號(hào)通路，見圖6B。

圖6 重復(fù)基因韋恩圖（A） 及富集分析（B） 圖

3 討論

心腦血管疾病是人類首要致死因素，動(dòng)脈粥樣硬化是其主要病理基礎(chǔ)［14］。中醫(yī)學(xué)中并沒有動(dòng)脈粥樣硬化病名，而是根據(jù)其臨床癥狀將該病歸屬于“頭痛” “眩暈” “中風(fēng)” “胸痹” 等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，氣血陰陽虧虛為本，氣滯、血瘀、痰濕為標(biāo)。盾葉薯蕷俗稱黃姜，以根狀莖入藥，其性味甘、苦、涼，具有清肺止咳、利濕通淋、解毒消腫和通經(jīng)絡(luò)等功效。盾葉冠心寧片的主要成分為盾葉薯蕷，具有活血化瘀、行氣止痛、養(yǎng)血安神的功效。臨床研究也表明盾葉冠心寧片治療動(dòng)脈粥樣硬化效果顯著，可減少臨床心腦血管疾病發(fā)作數(shù)、調(diào)節(jié)血脂、降低同型半胱氨酸水平，但作用機(jī)制不明［15-17］。

載脂蛋白E （ApoE） 基因敲除小鼠因缺乏清除血漿中膽固醇的殘粒的能力，所以可以在短期內(nèi)通過高脂飼料喂養(yǎng)形成動(dòng)脈粥樣硬化模型［18］。本研究中為了探究盾葉冠心寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制，采用ApoE-/-小鼠作為模型，觀察盾葉冠心寧片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠的作用，同時(shí)構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并篩選其中的關(guān)鍵通路來探究其作用機(jī)制。病理結(jié)果表明，與模型組比較，盾葉組小鼠主動(dòng)脈竇處粥樣斑塊面積減小，提示盾葉冠心寧片可減少小鼠主動(dòng)脈壁內(nèi)的斑塊形成。據(jù)目前研究認(rèn)為，減少斑塊脂質(zhì)核心的大小是穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的主要策略之一［19］。根據(jù)Masson 染色結(jié)果顯示，與模型組比較，盾葉組小鼠斑塊中膠原纖維水平增加，提示盾葉冠心寧片可增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盾葉冠心寧片具有減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的同時(shí)穩(wěn)定斑塊的作用。

研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 和lncRNAs 在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病和發(fā)展中扮演重要角色。miRNAs 已經(jīng)成為一些生理和病理生理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，包括膽固醇外流、脂質(zhì)代謝、平滑肌增殖、炎癥反應(yīng)。lncRNAs 被認(rèn)為是一組新的表觀遺傳調(diào)控因子，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、脂質(zhì)代謝、炎癥和免疫反應(yīng)［20］。本研究在既往研究基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建lncRNAmiRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)盾葉冠心寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂蛋白驅(qū)動(dòng)的疾病，脂質(zhì)代謝障礙為其的病變基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，盾葉冠心寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能主要與脂質(zhì)代謝有關(guān)，如脂肪酸代謝、脂質(zhì)代謝過程、脂類生物合成、PPAR 信號(hào)通路。PPAR 信號(hào)通路參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，可有效促進(jìn)細(xì)胞排出過量的脂質(zhì)，是正常機(jī)體維持脂代謝平衡的重要通路之一［21］，本研究結(jié)果與之一致。

綜上所述，本研究中構(gòu)建的盾葉冠心寧片抗動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)為后續(xù)更深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵基因及基因間的調(diào)控關(guān)系提供了參考和方向。然而本研究未對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步分析并予以證實(shí)。