周喜燕，馬曉維，李 彬，張鑫鑫，郭 聯，于 淼，王 群

［青島市中醫(yī)醫(yī)院（市海慈醫(yī)院） 神經內科，山東 青島 266033］

帕金森病又稱震顫麻痹，是第二常見的神經退行性疾病，主要發(fā)生于中老年人［1］。帕金森病臨床表現包括靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵硬、平衡障礙和姿勢不穩(wěn)； 非運動癥狀包括嗅覺功能障礙、疼痛、疲勞、睡眠障礙、自主神經功能障礙和認知功能障礙等，嚴重影響患者生活質量［2］。大量證據表明，中腦黑質部位發(fā)生多巴胺能神經元凋亡是帕金森病的主要病因和癥結［3］。因此，探索帕金森病發(fā)病機制，尋找新的治療策略已迫在眉睫。

獐牙菜苦苷是一種從龍膽科藥用植物中分離出的裂環(huán)烯醚萜苷［4］，可預防多種炎癥相關疾病。研究報道，獐牙菜苦苷可通過增強α-synuclein 抑制基因和MAPK 通路激活SKN-1/NRF-2 抑制帕金森病相關神經毒性［5］。但獐牙菜苦苷治療帕金森病的藥理分子機制尚不清楚。微小RNA（microRNA） 是一類長度僅為18～25 bp 的非編碼RNA，研究表明，miR-351-5p 可通過靶向MAPK13 和sirtuin-6 促進腸黏膜氧化應激、炎癥和凋亡，從而加重腸缺血/再灌注損傷［6］。在脂多糖（LPS） 誘導的急性肺損傷中，miR-351-5p表達升高，抑制miR-351-5p表達可減輕肺氧化應激和炎癥，過表達miR-351-5p則相反［7］。然而，miR-351-5p在帕金森病中的作用尚未可知。因此，本實驗旨在研究獐牙菜苦苷對6-羥基多巴（6-OHDA） 誘導PC12 細胞損傷的影響，探究其對miR-351-5p 的調控作用，為帕金森病的治療提供新方向。

1 材料

PC12 細胞購自無錫欣潤生物科技有限公司。獐牙菜苦苷（純度＞98%，貨號110785-201904，中國食品藥品檢定研究院）。6-OHDA （美國Sigma 公司）； 胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）； MTT 試劑盒（上海美軒生物科技有限公司）； LDH、SOD 和MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）； Annexin V-FITC / PI 法試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）； RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA） 試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；TRIzol 試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒 （日本TaKaRa 公司）； Lipofectamine2000 轉染試劑 （ 美國Invitrogen 公司）。

2 方法

2.1 細胞分組與處理 以含100 μmol/L 6-OHDA 的細胞培養(yǎng)液處理PC12 細胞24 h，記為6-OHDA 組［8］； 未經6-OHDA 處理的記為對照組； 用30、60、120 μmol/L 獐牙菜苦苷［9］處理PC12 細胞24 h，再經6-OHDA 處理，分別記為獐牙菜苦苷低、中、高劑量組； 分別將anti-miR-NC、antimiR-351-5p 轉染至PC12 細胞，再經6-OHDA 處理，記為anti-miR-NC 組、anti-miR-351-5p 組； 分別將miR-NC、miR-351-5p 轉染至PC12 細胞，再經120 μmol/L 獐牙菜苦苷和6-OHDA 處理，記為獐牙菜苦苷+miR-NC 組、獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組。各組轉染操作按照Lipofectamine2000 試劑盒說明書進行。

2.2 MTT 法檢測細胞存活率 將各組PC12 細胞以2×105/mL 密度接種于96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，酶標儀檢測490 nm 波長處的吸光度（OD） 值，并計算細胞存活率，公式為細胞存活率＝ （OD實驗組/OD對照組） ×100%。

2.3 LDH、SOD 活性和MDA 水平檢測 取各組PC12 細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心后收集上清液，按照試劑盒說明檢測LDH、SOD 活性和MDA 水平。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 按照Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書檢測PC12 細胞凋亡，收集各組細胞并用PBS 漂洗，0.25%胰蛋白酶消化液消化，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 漂洗2 次，離心后收集細胞，195 μL 結合緩沖液重懸，加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL 碘化丙啶（PI），37 ℃孵育15 min 后，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 Western blot 法檢測細胞Bax、Bcl-2 蛋白表達 收集各組PC12 細胞，加入細胞裂解液200 μL，于冰上裂解，離心收集上清蛋白樣品，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，將Loading buffer 與蛋白樣品充分混勻，沸水浴加熱5 min致蛋白變性。取60 μg 變性蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，而后轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入Bcl-2、Bax 一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3次，加入二抗（1 ∶2 000） 室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，滴加ECL 顯色液，暗室中曝光顯影，定影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達量以其與內參的灰度值比值表示。

2.6 RT-qPCR 法檢測miR-351-5p表達 采用TRIzol 試劑提取各組PC12 細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以U6 為內參，用cDNA 作為模板進行RT-qPCR 反應，反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCT法計算miR-351-5p相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞存活率的影響 如表1 所示，與對照組比較，6-OHDA 組PC12 細胞存活率降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細胞存活率升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表1 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞存活率的影響（±s，n＝9）

表1 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞存活率的影響（±s，n＝9）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別存活率/%對照組100.00±0.00 6-OHDA 組42.04±3.29*獐牙菜苦苷低劑量組54.67±4.06＃獐牙菜苦苷中劑量組67.72±5.51＃獐牙菜苦苷高劑量組79.72±5.50＃

3.2 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞氧化應激的影響 如表2 所示，與對照組比較，6-OHDA 組PC12 細胞LDH 活性和MDA 水平升高 （P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細胞LDH 活性和MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表2 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞氧化應激的影響（±s，n＝9）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1）MDA/（nmol·mg-1）對照組24.57±2.3491.45±8.094.06±0.33 6-OHDA 組80.66±7.48* 32.57±3.17* 32.57±3.18*獐牙菜苦苷低劑量組 65.38±5.08＃49.03±4.12＃ 24.33±2.28＃獐牙菜苦苷中劑量組 50.02±4.86＃64.72±5.46＃ 16.21±1.34＃獐牙菜苦苷高劑量組 33.94±3.14＃83.68±6.05＃ 7.74±0.68＃

3.3 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞凋亡的影響如圖1、表3 所示，與對照組比較，6-OHDA 組PC12 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖1 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞凋亡的影響

表3 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞凋亡的影響（±s，n＝9）

表3 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞凋亡的影響（±s，n＝9）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白對照組5.43±0.470.63±0.050.23±0.02 6-OHDA 組32.72±2.96*0.14±0.02* 0.74±0.06*獐牙菜苦苷低劑量組 23.91±2.05＃0.26±0.02＃0.60±0.05＃獐牙菜苦苷中劑量組 15.96±1.23＃0.39±0.03＃0.46±0.04＃獐牙菜苦苷高劑量組 8.96±0.68＃0.54±0.04＃0.31±0.03＃

3.4 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞miR-351-5p表達的影響 如表4 所示，與對照組比較，6-OHDA 組PC12細胞miR-351-5p表達升高（P＜0.05）； 與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷各劑量組PC12 細胞miR-351-5p表達降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表4 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞miR-351-5p表達的影響（±s，n＝9）

表4 獐牙菜苦苷對6-OHDA 誘導PC12 細胞miR-351-5p表達的影響（±s，n＝9）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與6-OHDA 組比較，＃P＜0.05。

組別miR-351-5p對照組1.00±0.00 6-OHDA 組3.49±0.28*獐牙菜苦苷低劑量組2.55±0.22＃獐牙菜苦苷中劑量組1.92±0.18＃獐牙菜苦苷高劑量組1.31±0.12＃

3.5 干擾miR-351-5p表達對6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響 如圖2、表5 所示，與anti-miR-NC 組比較，antimiR-351-5p 組PC12 細胞miR-351-5p表達降低（P＜0.05），存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.05），LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖2 干擾miR-351-5p 表達對6-OHDA 誘導PC12 細胞凋亡的影響

表5 干擾miR-351-5p 表達對6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響（±s，n＝9）

表5 干擾miR-351-5p 表達對6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響（±s，n＝9）

注： 與anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-351-5p存活率/%LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白anti-miR-NC 組1.00±0.0040.05±4.0885.16±7.4331.17±3.1133.57±3.1733.19±2.380.13±0.020.77±0.05 anti-miR-351-5p 組0.38±0.03* 70.01±5.59* 40.96±4.02* 74.47±6.56*13.13±1.04*14.04±1.16* 0.46±0.04*0.37±0.03*

3.6 上調miR-351-5p表達對獐牙菜苦苷干預6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響 如圖3、表6 所示，與6-OHDA+獐牙菜苦苷+miR-NC 組比較，6-OHDA+獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組PC12 細胞中miR-351-5p 表達升高（P＜0.05），細胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達升高（P＜0.05）。

圖3 上調miR-351-5p 表達對獐牙菜苦苷干預6-OHDA誘導PC12 細胞凋亡的影響

表6 上調miR-351-5p 表達對獐牙菜苦苷干預6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響（±s，n＝9）

表6 上調miR-351-5p 表達對獐牙菜苦苷干預6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的影響（±s，n＝9）

注： 與獐牙菜苦苷+miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-351-5p存活率/% LDH/（U·L-1） SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1） 凋亡率/%Bcl-2 蛋白Bax 蛋白獐牙菜苦苷+miR-NC 組1.00±0.00 81.48±6.41 31.68±3.0284.28±6.787.27±0.678.27±0.620.56±0.050.30±0.03獐牙菜苦苷+miR-351-5p 組 2.78±0.24* 51.06±4.23* 70.97±5.77* 45.23±4.09*23.16±2.26*21.75±2.13* 0.25±0.03*0.63±0.05*

4 討論

為研究帕金森病細胞損傷分子機制，本實驗用100 μmol/L 6-OHDA 處理PC12 細胞24 h，構建PC12 細胞損傷模型，結果顯示，與對照組比較，6-OHDA 組PC12 細胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達降低，LDH 活性、MDA水平、凋亡率、Bax 蛋白表達升高，提示6-OHDA 可誘導PC12 細胞凋亡和氧化應激。

傳統(tǒng)療法和草藥療法由于其副作用較低或無副作用的優(yōu)勢，越來越得到重視。獐牙菜苦苷是龍膽科植物的主要生物活性成分，具有抗菌、抗炎、抗糖尿病等多種藥理作用。獐牙菜苦苷可通過降低腎細胞中阿格嘧啶、氧化應激和上皮間質轉化水平來預防甲基乙二醛介導的糖尿病發(fā)病機制［10］。獐牙菜苦苷可減輕高脂飲食誘導的小鼠體質量、葡萄糖不耐受、氧化應激和胰島素抵抗，增強胰島素信號，預防肥胖相關的慢性炎癥［11］。獐牙菜苦苷可改善香煙煙霧誘導的前列腺膠原沉積，減輕氧化應激和局部炎癥，抑制香煙煙霧誘導的前列腺纖維化［12］。獐牙菜苦苷可通過TLR4/PARP1/NF-κB 途徑減弱ROS 水平，抑制細胞凋亡，緩解氧糖剝奪/復氧誘導的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y損傷［13］。獐牙菜苦苷可通過抑制氧化應激和炎癥反應緩解四氯化碳引起的肝損傷［14］。與上述研究結果一致，本實驗結果顯示，與6-OHDA 組比較，獐牙菜苦苷以劑量依賴方式升高PC12 細胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達，降低LDH 活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達，提示獐牙菜苦苷可緩解6-OHDA 誘導的PC12 細胞損傷。

眾多研究發(fā)現，microRNA 的異常表達與帕金森病發(fā)生和發(fā)展有關。在1-甲基-4-苯基吡啶 （MPP） 處理的SHSY5Y 細胞中，miR-29c-3p 表達下調，miR-29c-3p 可通過下調TET2 表達抑制SH-SY5Y 細胞自噬過程［15］。在帕金森病細胞模型中，miR-133b 表達降低，過表達miR-133b 可抑制MPP 誘導的PC12 細胞凋亡［16］。在MPP 處理的SH-SY5Y細胞中miR-497-5p 表達升高，下調miR-497-5p 可抑制MPP誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡［17］。抑制miR-6862 表達可保護神經細胞免受MPP 誘導的細胞凋亡［18］。miR-421k 可通過直接靶向MEF2D 加重帕金森病模型神經毒性并促進細胞死亡［19］。與上述研究結果一致，本實驗結果顯示，與對照組比較，6-OHDA 組miR-351-5p表達升高，干擾miR-351-5p表達升高了PC12 細胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達，降低了LDH 活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達，提示干擾miR-351-5p表達可抑制6-OHDA 誘導的PC12 細胞凋亡和氧化應激。

研究表明，天然藥物提取物可通過調控microRNA 表達緩解帕金森病細胞損傷。如蝦青素可通過靶向miR-7/SNCA軸抑制內質網應激并保護帕金森病引起的神經元損傷［20］。迷迭香酸可通過調節(jié)miR-155-5p 減輕帕金森病小鼠模型中炎癥、凋亡和氧化應激，上調miR-155-5p 可抑制迷迭香酸對帕金森病小鼠運動障礙的緩解作用［21］。與上述研究結果一致，本實驗結果顯示，獐牙菜苦苷以劑量依賴方式降低6-OHDA 組miR-351-5p表達，上調miR-351-5p表達逆轉了獐牙菜苦苷處理對6-OHDA 誘導PC12 細胞損傷的作用，使PC12 細胞存活率、SOD 活性、Bcl-2 蛋白表達降低，LDH活性、MDA 水平、凋亡率、Bax 蛋白表達升高，提示獐牙菜苦苷可通過調控miR-351-5p表達影響6-OHDA 誘導的PC12 細胞損傷。

綜上所述，miR-351-5p表達在6-OHDA 誘導的PC12 細胞損傷中上調，獐牙菜苦苷可通過下調miR-351-5p表達抑制6-OHDA 誘導的凋亡和氧化應激，為獐牙菜苦苷治療帕金森病提供新思路。