王 振，楊秀書，陳衛(wèi)紅，田 野，王曉東，儲鑄鋼，羅光恒

（貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽 550002）

腎結石通常指結石出現(xiàn)于腎盞、腎盂及腎盂與輸尿管之間的結石［1］。近幾年，國內約5% ～15%的人群遭受該疾病的困擾，且有逐年增長的趨勢［2-3］。腎結石的發(fā)病多與環(huán)境和飲食習慣等因素相關［4-5］。腎鈣質沉積癥會導致嚴重的腎損傷，血清中肌酐、尿素氮水平，尿液中的尿肌酐、尿微量白蛋白水平異常［6-7］。草酸鈣晶體的沉積也會誘使NLRP3 炎癥小體的激活進而誘導樹突狀細胞IL-1β 的分泌，最終導致腎內炎癥反應［8］。炎癥小體介導caspase-1 參與細胞焦亡為一種炎性細胞程序性細胞死亡，細胞焦亡能夠加重腎損傷的病理損害［9-10］。

川芎嗪是川芎的生物堿類活性成分［11］。川芎嗪能通過調控NLRP3 抑制炎癥因子的產生，對急性肺損傷大鼠具有保護作用［12］。NLRP3 炎癥小體是分布于細胞胞漿內的蛋白復合體，包括NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 （caspase-1），能識別內外環(huán)境中刺激信號，激活caspase-1，促進白介素1β （IL-1β） 等細胞因子的分泌［13］。但川芎嗪是否能通過調控NLRP3 的激活減輕腎結石誘導的腎損傷，還未見報道。因此，本研究通過建立大鼠腎結石模型探究川芎嗪對腎結石導致的腎臟損傷的保護作用。

1 材料

1.1 試劑與藥物 川芎嗪（編號DR10670），純度≥98%，購自鼎瑞化工（上海） 有限公司。NGAL、IL-1β、IL-18 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司； IL-1β、IL-18、NLRP3 抗體均購自英國Abcam 公司； HRP 標記的IgG 山羊抗小鼠二抗、cleaved-caspase1 抗體均購自生工生物工程（上海） 股份有限公司； DAPI 封片劑（貨號40727ES10）、TUNEL 凋亡檢測試劑盒（貨號40307ES20）、蘇木精-尹紅染料（貨號60502ES50） 均購自上海翊圣生物科技有限公司； β-肌動蛋白（β-actin） 抗體（批號TA-09）、DAB 顯色液（批號k175914A） 均購自北京中杉金橋生物技術有限公司； 尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附檢測 （ELISA） 試劑盒（批號GR201802-1） 購自武漢基因美生物科技有限公司。氯化銨購自上海瀚香生物科技有限公司； 乙二醇購自上海易恩化學技術有限公司。

1.2 動物 SPF 級SD 雄性大鼠24 只，體質量195～210 g，購自成都達碩實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （川） 2020-0030］。適應性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，12 h/12 h 明暗交替，溫度20 ～26 ℃，相對濕度40% ～70%，自由飲水進食。

2 方法

2.1 動物分組及造模 將大鼠隨機分為空白組，模型組，川芎嗪低、高劑量組，每組6 只?？瞻捉M大鼠正常飼喂，每天灌胃給予蒸餾水2 mL。其余各組大鼠給予添加1.25%乙二醇的水，自由飲用，持續(xù)14 d，同時每天灌胃給予1%氯化銨2 mL 建立大鼠腎結石模型。實驗第2 天起，空白組和模型組大鼠每天灌胃給予生理鹽水2 mL，川芎嗪低、高劑量組大鼠每天灌胃給予50、100 mg/kg 川芎嗪，持續(xù)4周。給藥結束后，收集大鼠24 h 尿液用于生化指標檢測。處死大鼠收集血液以及腎臟組織用于后續(xù)各指標檢測。

2.2 川芎嗪對腎結石大鼠血清、尿液生化指標影響 各組大鼠靜脈取血，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，采用半自動生化檢測儀檢測大鼠血清尿素、血肌酐水平。取“2.1” 項下各組大鼠24 h 尿液，采用半自動生化檢測儀檢測大鼠尿肌酐水平。

2.3 ELISA 法檢測大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18、尿微量白蛋白的水平 取“2.1” 項下各組大鼠血液，4 ℃下放置1 h，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，收集上清液備用。嚴格按照相關試劑盒說明書操作，檢測大鼠尿微量白蛋白的水平。用洗滌液或樣品稀釋液將標準液稀釋至所需濃度，按排列順序依次加入50～100 μL/孔稀釋好的標準液、各組大鼠血清上清液、去離子超純水，室溫或孵育30 ～60 min。采用多功能酶標儀于450 nm 波長處檢測吸光度值，根據(jù)各個孔的吸光度值分析大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平。

2.4 HE 染色觀察大鼠腎組織病理變化 取各組大鼠腎組織，用提前預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4） 和生理鹽水沖洗。腎組織用4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色。評估腎組織病理改變的嚴重程度，對雙腎結石數(shù)目進行評分（無結石、結晶形成為1 分； 少量結石、結晶形成，每個視野3 個以下為2 分； 較多結石、結晶形成，每個視野3～5 個為3 分； 較多結石、結晶形成，每個視野6～10 個為4 分）。

2.5 TUNEL 染色檢測細胞凋亡 取各組大鼠腎組織，PBS清洗，多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片，水化，脫蠟，37 ℃避光孵育30 min，使細胞膜變通透，用100 μL 1×Equilibration Buffer 固定10 ～30 min，吸出上清液用Alexa Flour 488-dUTP Labeling Mix 37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌，用含DAPI 封片劑封閉細胞，在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像進行分析。

2.6 Western blot 法檢測腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達 將各組大鼠腎組織切成小塊，稱取相同質量，加入300 μL 蛋白裂解液，冰上超聲裂解10 min，100 ℃金屬浴10 min，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后加熱變性，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法將蛋白轉膜，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，與兔抗鼠NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18、β-actin 一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗4 次，與山羊抗兔IgGHRP 二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBST 清洗4 次，ECL 顯色，定影，將膠片進行掃描，通過Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 川芎嗪對腎結石大鼠腎功能和炎癥水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中尿素、肌酐及尿液中24 h 尿蛋白水平升高（P＜0.01），尿肌酐水平降低（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠24 h 尿蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01），川芎嗪高劑量組大鼠血清肌酐水平降低（P＜0.01），尿肌酐水平升高（P＜0.01），血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 川芎嗪對腎結石大鼠腎功能和炎癥水平的影響（±s，n＝6）

3.2 川芎嗪對腎結石大鼠腎臟病理的影響 空白組大鼠腎臟組織被膜較為完整，未見變性、壞死和脫落，未見明顯病理改變； 模型組大鼠出現(xiàn)部分腎小管有所擴張，伴隨上皮細胞扁平化，部分腎皮質和髓質腎小管管腔內見不著色、帶折光性的透明結晶沉積，亦可見細胞管型，腎小管變性壞死區(qū)域間質內見少量纖維組織增生，以核呈長梭形的纖維細胞增生為主，部分伴有少量炎細胞浸潤； 川芎嗪各劑量組大鼠部分腎皮質和髓質腎小管管腔內見透明結晶沉積，腎小管變性壞死區(qū)域間質內見少量纖維組織增生，提示川芎嗪能改善大鼠腎組織的病變，見圖2A。與空白組比較，模型組大鼠腎結石評分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎結石評分降低（P＜0.01），見圖2B。與空白組比較，模型組大鼠腎組織細胞凋亡率升高（P＜0.01），腎組織凋亡陽性細胞增加； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎組織細胞凋亡率降低（P＜0.01），氯化銨晶體結石造成的腎臟細胞凋亡現(xiàn)象則幾乎消失，提示川芎嗪能夠減弱結石造成的細胞凋亡，見圖2C～2D。

圖2 川芎嗪對腎結石大鼠腎臟病理的影響（±s，n＝6）

3.3 川芎嗪對腎結石大鼠腎組織 NLRP3、cleavedcaspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，川芎嗪各劑量組大鼠腎組織IL-18 蛋白表達降低（P＜0.05），川芎嗪高劑量組大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖3 川芎嗪對腎結石大鼠腎組織NLRP3、cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18 蛋白表達的影響（±s，n＝6）

4 討論

腎結石是泌尿系統(tǒng)常見的疾病，其中泌尿系結石能夠引起尿路損傷和感染甚至泌尿系的梗阻，治療不及時或長期的存在，還會影響腎臟功能，增加泌尿系腫瘤的發(fā)生概率［14］。腎結石通常也會伴隨腎損傷、腎功能異常等其他常見并發(fā)癥［15］。因此，尋找新的藥物對腎結石造成的腎損傷進行修復能有效改善患者的生活質量，降低腎結石的治療成本。本研究利用氯化銨建立腎結石大鼠模型，并探究川芎嗪對腎臟NLRP3 炎癥小體的抑制作用以及對腎臟功能的改善作用。結果表明，腎結石大鼠血清NGAL、IL-1β、IL-18 水平升高，血清肌酐、尿素和尿肌酐、24 h 尿蛋白水平出現(xiàn)異常，表明腎結石大鼠出現(xiàn)腎功能異常。川芎嗪可降低腎結石大鼠血清肌酐和尿素氮水平，同時也能抑制炎癥因子IL-1β、IL-18 的產生，提示其能緩解腎結石造成的腎損傷并減弱腎結石造成的炎癥反應，發(fā)揮腎臟的保護作用。

炎癥反應是腎臟損傷的重要因素，NLRP3 是炎癥反應的關鍵啟動因子［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體在各類腎病所導致的腎損傷過程中發(fā)揮著極為重要的作用。NLRP3 炎癥小體能通過誘導caspase-1 活化，促使IL-1β、IL-18 的產生，使機體產生炎癥反應。腎結石造成的腎功能異常會出現(xiàn)NLRP3 炎癥小體的激活，導致腎臟炎癥反應的發(fā)生，影響腎臟的功能［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可降低腎結石大鼠腎臟IL-1β、TNF-α 水平，同時減弱cleavedcaspase1 蛋白表達，提示川芎嗪可抑制腎結石誘導的NLRP3 炎癥小體的活化，從而抑制炎癥因子水平，起到保護腎臟的作用。本研究初步探討川芎嗪對腎結石大鼠的保護作用，對于其作用機制還需要進一步研究。