郭 真，王伊雯，戚 莉，劉 佳，杜 曾，邱劍楠，王曉檸

（上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 201203）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是目前全球最常見的慢性肝病，普通成人NAFLD患病率約為6.3% ～45%［1］。NAFLD 是一種代謝應(yīng)激性肝損傷，目前尚無特效治療藥物［2］。三七脂肝丸是目前臨床用于治療NAFLD，且具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的中成藥之一［3］，但其作用機制尚不清晰。本實驗使用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 大鼠模型，觀察三七脂肝丸對模型大鼠的藥效，并從肝臟脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成以及腸道緊密連接角度，探索三七脂肝丸治療NAFLD 的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠48 只，體質(zhì)量180 ～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （滬） 2017-0005］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，恒溫23 ～24 ℃，相對濕度 （60±10）%，晝夜節(jié)律控制，自由飲水。本研究動物實驗經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批通過 （倫理號PZSHUTCM200703012）。

1.2 試劑與藥物 高脂飼料（批號20200806，南通特洛菲飼料科技有限公司）。三七脂肝丸 （國藥準(zhǔn)字Z20025353，批號20181105，云南玉藥生物制藥有限公司）； 奧貝膽酸（批號20200707，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。血清肝功能生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）； 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（cluster of differentiation 36，CD36）、硬脂酰輔酶A 去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD-1）抗體（貨號ab252922、ab19862，英國Abcam 公司）； 脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A 羥化酶（acetyl-coA carboxylase，ACC1） 抗體 （貨號3180、4190，美國CST 公司）； 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c （sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c） 抗體（貨號sc13551，美國Santa Cruz 公司）； 閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白 （Occludin） 抗體（貨號61-7300、33-1500，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； β-肌動蛋白 （β-actin） 抗體 （貨號66009-1，美國Proteintech 公司）； 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒 （貨號A0208、A0216、P0012S、P0012AC，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 TBA-40FR 全自動生化儀（日本東芝公司）；Tissuelyser-24 全自動快速樣品研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）； Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Fresco17 低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；MTC-100 恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）； Tanon-3500 全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）； RO lab/RO DI 實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將48 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組、模型組、奧貝膽酸組和三七脂肝丸低、中、高劑量組，每組8 只。除正常組外，其余各組使用高脂飼料喂養(yǎng)12 周誘導(dǎo)NAFLD 大鼠模型［4-5］。第9 周起，正常組和模型組大鼠灌胃給予10 mL/kg 去離子水； 三七脂肝丸低、中、高劑量組分別灌胃給予0.77、1.54、3.08 g/kg（臨床等效劑量的0.5、1、2 倍） 三七脂肝丸混懸液； 奧貝膽酸組灌胃給予0.514 mg/kg 奧貝膽酸，以每天10 mL/kg容量灌胃。

2.2 取材 12 周后處死所有大鼠，采集全血和肝、回腸組織。全血4 ℃靜置3 h，1 000 ×g離心15 min，分裝血清。采集肝臟，稱重，留取肝、回腸組織標(biāo)本。肝臟取相同部位組織浸入中性福爾馬林溶液中固定。肝、回腸組織分裝在凍存管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 組織病理學(xué)檢測 肝組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，分別行HE、油紅O 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。通過Image Pro plus 6.0 軟件分析油紅O 陽性染色面積比值。

2.4 血清、肝組織生化指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇 （high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、游離脂肪酸 （free fatty acid，F(xiàn)FA） 水平； 試劑盒法檢測肝組織TG、FFA 水平。

2.5 Western blot 法檢測肝組織脂肪合成、代謝相關(guān)蛋白以及回腸緊密連接蛋白表達 將40 ～50 mg 肝、回腸組織裂解后取上清，BCA 法蛋白定量后，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，顯影成像。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，符合正態(tài)分布及方差齊性者，組間比較采用單因素方差分析； 方差不齊者，組間比較采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 模型復(fù)制過程中，正常組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，毛色光澤，飲食、二便正常，精神狀態(tài)良好；模型組大鼠體質(zhì)量快速增加，毛色光澤油亮，精神狀態(tài)良好。造模及給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)均升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量降低（P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸中、高劑量組肝指數(shù)降低（P＜0.05），見表1。

表1 三七脂肝丸對大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別體質(zhì)量/g肝質(zhì)量/g肝指數(shù)/%正常組415.80±32.779.79±0.872.35±0.06模型組474.90±21.52△△11.98±0.89△△2.53±0.25△三七脂肝丸低劑量組423.30±23.23**10.72±0.83*2.54±0.23三七脂肝丸中劑量組413.80±36.36**9.66±0.72**2.34±0.13*三七脂肝丸高劑量組414.30±27.73**9.81±0.64**2.37±0.08*奧貝膽酸組440.40±34.45*10.67±0.45*2.43±0.12

3.2 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清肝功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清ALT、AST 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清肝功能的影響（IU/L，±s，n＝8）

表2 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清肝功能的影響（IU/L，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別ALTAST正常組14.71±3.0085.11±12.65模型組20.82±3.67△115.80±6.08△△三七脂肝丸低劑量組15.23±3.37*87.33±12.37*三七脂肝丸中劑量組11.56±6.95*84.00±19.43**三七脂肝丸高劑量組13.89±2.23**83.20±6.54**奧貝膽酸組15.44±5.94*75.00±17.02**

3.3 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-c、FFA 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清FFA 水平降低（P＜0.05），三七脂肝丸中、高劑量組和奧貝膽酸組大鼠血清TC、TG 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸高劑量組大鼠血清LDL-c 水平降低（P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠血清HDL-c 水平升高 （P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸高劑量組血清LDL-c 水平降低（P＜0.01），見表3。

表3 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

表3 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠血清脂質(zhì)水平的影響（mmol/L，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與奧貝膽酸組比較，＃＃P＜0.01。

組別TCTGHDL-cLDL-cFFA正常組1.60±0.081.43±0.341.10±0.070.22±0.030.36±0.08模型組1.81±0.15△2.54±0.36△△0.77±0.050△△0.35±0.030△△0.46±0.05△三七脂肝丸低劑量組1.60±0.312.05±0.640.82±0.160.35±0.060.32±0.12*三七脂肝丸中劑量組1.48±0.24*1.80±0.50*0.85±0.120.32±0.050.33±0.04*三七脂肝丸高劑量組1.45±0.14*1.73±0.62*0.88±0.160.28±0.03**＃＃0.32±0.07*奧貝膽酸組1.48±0.24*1.49±0.15**0.95±0.08**0.34±0.020.30±0.05*

3.4 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織FFA、TG 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FFA、TG 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠肝組織TG 水平降低（P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FFA 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響（mmol/g，±s，n＝8）

表4 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織FFA、TG 水平的影響（mmol/g，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△△P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01； 與奧貝膽酸組比較，＃P＜0.05。

組別FFATG正常組0.20±0.081.02±0.31模型組0.42±0.04△△1.79±0.61△△三七脂肝丸低劑量組0.40±0.071.75±0.38三七脂肝丸中劑量組0.26±0.07**＃0.97±0.51**三七脂肝丸高劑量組0.29±0.02**＃1.15±0.43*奧貝膽酸組0.36±0.030.97±0.51**

3.5 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織病理學(xué)的影響 HE染色顯示，正常組大鼠肝細胞形態(tài)正常，肝索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細胞浸潤； 與正常組比較，模型組大鼠肝臟可見大小泡混合性肝細胞脂肪變性，伴有小葉內(nèi)炎性細胞浸潤，其肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變以及NAS 積分升高（P＜0.01），符合NAFLD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2，6］； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組大鼠肝臟脂肪變性及細胞浸潤情況均有所改善，其中三七脂肝丸高劑量組和奧貝膽酸組肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變以及NAS 積分降低（P＜0.05，P＜0.01），三七脂肝丸中劑量組肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥以及NAS 積分降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1、表5。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×400）

表5 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織NAS 病理評分及油紅O 陽染面積比的影響（±s，n＝8）

表5 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織NAS 病理評分及油紅O 陽染面積比的影響（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別脂肪變/分小葉內(nèi)炎癥/分氣球樣變/分NAS 積分/分油紅O 陽染面積比/%正常組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.006.76±0.11模型組2.25±0.50△△1.75±0.50△△1.50±0.58△△5.50±1.00△△44.12±1.41△△三七脂肝丸低劑量組1.75±0.501.25±0.501.25±0.504.25±0.5031.22±1.33三七脂肝丸中劑量組0.50±0.58**0.75±0.50*0.75±0.502.00±0.81**21.76±1.09**三七脂肝丸高劑量組0.50±0.58**0.25±0.50**0.25±0.50*1.00±0.81**10.88±1.65**奧貝膽酸組0.75±0.50**0.75±0.50*0.25±0.50*1.75±0.50**15.86±0.69**

油紅O 染色顯示，正常組大鼠肝組織未見紅色脂肪滴；與正常組比較，模型組大鼠肝組織可見脂肪浸潤，油紅O陽染面積比升高（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸各劑量組和奧貝膽酸組肝組織脂肪浸潤減輕，其中三七脂肝丸中、高劑量組和奧貝膽酸組油紅O 陽染面積比降低（P＜0.01），見圖2、見表5。

圖2 各組大鼠肝組織油紅O 染色（×200）

3.6 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），SCD-1 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），SCD-1 蛋白表達升高（P＜0.01），三七脂肝丸低劑量組大鼠肝組織SREBP-1c、CD36 蛋白表達降低（P＜0.01），奧貝膽酸組大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與奧貝膽酸組比較，三七脂肝丸中劑量組肝組織FAS 蛋白表達降低（P＜0.01），三七脂肝丸中、高劑量組肝組織SCD-1 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖3。

圖3 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠肝組織FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

3.7 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠回腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，三七脂肝丸高劑量組和奧貝膽酸組回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

圖4 三七脂肝丸對NAFLD 大鼠回腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

4 討論

肝臟是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的重要器官，負責(zé)脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成（de novo lipogenesis，DNL）、脂肪酸氧化和脂質(zhì)輸出。當(dāng)脂肪酸的攝入、合成超過氧化和輸出時，肝細胞TG 過度蓄積是NAFLD 的主要病理特征。中醫(yī)認為，NAFLD 的病機是肝失疏泄、脾失健運［3］，根據(jù)臨床表現(xiàn)，治法上多以健脾化痰、清熱利濕、疏肝理氣為主［4-5］。三七脂肪丸的主要成分包括三七、莪術(shù)、云山楂、澤瀉、菊花等，具有健脾化濁、祛痰軟堅的功效，可治療肝郁脾虛型脂肪肝。臨床表明，三七脂肝丸能夠降低NAFLD 患者血脂水平，改善肝功能［6-7］。本實驗觀察到模型大鼠肝組織脂肪浸潤，血清ALT、AST 活性及TC、TG、LDL-c、FFA 水平升高，肝組織TG、FFA 水平升高，與文獻報道一致［8-9］。三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織TG、FFA 水平降低，脂肪浸潤減輕，提示三七脂肝丸能夠改善NAFLD 大鼠脂質(zhì)代謝狀態(tài)。

肝臟脂肪酸主要來源于CD36 攝取的肝外游離脂肪酸和肝臟DNL［10］。肝臟DNL 失調(diào)是NAFLD 形成的中心事件［11］。DNL 過程中脂肪酸生成的關(guān)鍵酶ACC 和FAS，均由SREBP-1c 轉(zhuǎn)錄調(diào)控［12］。SREBP-1c 表達增加能夠上調(diào)ACC和FAS 表達，促進脂肪酸合成。ACC 催化乙酰輔酶A 生成丙二酰輔酶A，不僅為長鏈脂肪酸合成提供底物，還可變構(gòu)抑制線粒體膜上的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，降低線粒體的脂肪酸β 氧化。SCD-1 是催化飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶，其催化產(chǎn)物單不飽和脂肪酸是甘油三酯生成的重要底物［13］。SCD-1 的去飽和作用將具有促炎作用的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為低脂毒性的單不飽和脂肪酸； 其表達減少或活性過低會導(dǎo)致高脂毒性的飽和脂肪酸積累，促進炎癥反應(yīng)［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，三七脂肝丸中、高劑量組大鼠肝組織CD36、SREBP-1c、ACC1 和FAS 表達降低，SCD-1表達升高，提示三七脂肝丸能夠減少肝細胞的脂肪酸攝入，抑制DNL，促進高脂毒性的飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化，減輕炎癥反應(yīng)。

除肝臟DNL 失調(diào)外，腸道黏膜屏障破壞也被認為是NAFLD 發(fā)生發(fā)展的重要因素［12］。腸道黏膜機械屏障破壞、通透性增加，腸內(nèi)細菌及微生物移位，脂多糖等外源性毒素進入門靜脈，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細胞脂肪變性，是NAFLD 發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)［15］。腸道黏膜機械屏障由腸上皮細胞及細胞間的緊密連接組成。腸緊密連接在調(diào)節(jié)腸道黏膜通透性方面具有重要作用，由閉合蛋白Claudin、Occludin 和連接黏附分子3 種膜蛋白以及ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等外周漿蛋白組成。ZO-1 蛋白與緊密連接的功能變化密切相關(guān)，被作為評價緊密連接通透性的指標(biāo)［16］。而缺乏Occludin 則不能形成典型的緊密連接結(jié)構(gòu)［17-18］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 患者小腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 表達降低［19］。動物實驗也證實，NAFLD 大鼠小腸組織ZO-1 和Occludin 蛋白表達降低，腸道黏膜機械屏障受損，通透性增加［20-21］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠小腸ZO-1 和Occludin 蛋白表達均較正常組降低，與文獻報道一致。三七脂肝丸高劑量組大鼠小腸ZO-1 和Occludin 蛋白表達較模型組升高，提示高劑量三七脂肝丸能夠改善NAFLD 腸道黏膜機械屏障功能。

綜上所述，三七脂肝丸能夠改善NAFLD 大鼠血清肝功能、脂質(zhì)水平、肝細胞脂肪變及腸道黏膜機械屏障損傷，其作用機制可能與調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸攝入、脂肪酸從頭合成，降低脂肪酸脂毒性的相關(guān)蛋白以及腸緊密連接蛋白表達密切相關(guān)。