李 沁，嚴(yán)璐佳，黃曉?shī)?，陳在?/p>

（福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350000）

小兒感冒顆粒由白薇、菊花等10 味中藥組成，是治療小兒風(fēng)熱感冒的常用中成藥，用于急性上呼吸道感染、流感病毒感染等［1-5］，目前關(guān)于該制劑質(zhì)量的研究大多集中在采用氣相或液相色譜法控制廣藿香、薄荷、板藍(lán)根、大青葉、菊花、連翹等藥味［6-15］，鮮有涉及白薇，并且尚無(wú)其專屬性成分測(cè)定的報(bào)道。課題組前期對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)小兒感冒顆粒的生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)一部分企業(yè)提供的白薇與2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的性狀特征不一致［16］，經(jīng)鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物老瓜頭CynanchumkomaroviiAl.Iljinski 的干燥根和根莖，也是目前市場(chǎng)上白薇最常見、最易混淆的偽品，但其全株有毒，相關(guān)成分主要是揮發(fā)油、生物堿，對(duì)動(dòng)物心、腎、肺部都有不同程度的毒性作用［17-19］，故以其替代投料時(shí)將會(huì)嚴(yán)重影響小兒感冒顆粒臨床有效性，并給患兒帶來(lái)極大的安全隱患。

前期報(bào)道，穆向榮等［20］在女金丸中發(fā)現(xiàn)了疑似老瓜頭摻偽白薇的現(xiàn)象，并采用HPLC-QE-Orbitrap-MS 高分辨質(zhì)譜確認(rèn)其特征性成分為6-芥子?；崽恰１緦?shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上建立UPLC-MS/MS 法檢查小兒感冒顆粒中白薇投料情況，一方面以對(duì)羥基苯乙酮檢查是否白薇投料正確，另一方面以6-芥子?；崽菣z查是否使用混淆品老瓜頭投料，從而為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 AB Sciex 5500 超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB Sciex 公司）； XPR105 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Milli-QA 超純水機(jī)（美國(guó)默克密理博公司）； Elmasonic S150 超聲波清洗器（德國(guó)艾瑪公司）。

1.2 試劑與藥物 對(duì)羥基苯乙酮（批號(hào)111897-201602，純度99.9%）、6-芥子?；崽牵ㄅ?hào)112074-202201） 對(duì)照品及白薇（白薇，批號(hào)121518-202105； 蔓生白薇，批號(hào)121755-202101） 對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。老瓜頭由生產(chǎn)企業(yè)寄送，經(jīng)福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院金鳴主任藥師鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物老瓜頭CynanchumkomaroviiAl.Iljinski 的干燥根和根莖。缺白薇陰性樣品由太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司提供，標(biāo)準(zhǔn)制劑、老瓜頭陽(yáng)性樣品均由實(shí)驗(yàn)室自制，統(tǒng)一按小兒感冒顆粒處方、工藝模擬制備。小兒感冒顆粒來(lái)自31 家藥品生產(chǎn)企業(yè)或經(jīng)營(yíng)企業(yè)，共91 批，均源于2022 年度國(guó)家藥品抽檢行動(dòng)，覆蓋全國(guó)除港澳臺(tái)地區(qū)以外的31 個(gè)省（自治區(qū)、直轄市），歷時(shí)5 個(gè)月，具有代表性，基本可反映該制劑本年度質(zhì)量情況。乙腈、乙酸銨為色譜純； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)羥基苯乙酮、6-芥子?；崽菍?duì)照品適量，甲醇溶解稀釋，制成每1 mL 分別含兩者19.90、22.16 μg/mL 的母液，分別精密吸取0.5、5 mL，置于100 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 藥材溶液 取藥材（白薇、蔓生白薇、老瓜頭）粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 甲醇，超聲（功率250 W，頻率40 kHz） 處理30 min，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于100 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.4 陰性樣品、陽(yáng)性樣品、標(biāo)準(zhǔn)制劑溶液 取缺白薇陰性樣品、老瓜頭陽(yáng)性樣品、標(biāo)準(zhǔn)制劑適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 UPLC-MS/MS 分析條件

2.2.1 色譜 Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -1 mmol/L 乙酸銨（B），梯度洗脫（0 ～9 min，6% ～18.5% A）； 體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源； 負(fù)離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式； 電離電壓（IS） -4 500 V； 氣簾氣（CUR） 35.0 psi（1 psi＝6.895 kPa）； 碰撞氣（CAD） 7 psi； 輔助加熱氣（GS1） 55.0 psi； 干燥氣 （GS2） 60.0 psi； 離子化溫度600 ℃，其他參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、藥材、缺白薇陰性樣品、老瓜頭陽(yáng)性樣品、標(biāo)準(zhǔn)制劑溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，對(duì)羥基苯乙酮作為白薇專屬性成分，同時(shí)在藥材（白薇、蔓生白薇）、標(biāo)準(zhǔn)制劑溶液中檢出，可用于檢查制劑是否為正品投料； 6-芥子?；崽亲鳛槔瞎项^專屬性成分，同時(shí)在藥材（老瓜頭）、老瓜頭陽(yáng)性樣品溶液中檢出，可用于檢查制劑是否為該偽品替代投料。

圖1 各成分UPLC-MS/MS 提取離子流圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下母液適量，甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，并分別以信噪比（S/N） ＝10、3 為定量限、檢出限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取本品（生產(chǎn)企業(yè)AA，批號(hào)201213）適量，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得對(duì)羥基苯乙酮、6-芥子酰基蔗糖峰面積RSD 分別為1.04%、1.10%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（生產(chǎn)企業(yè)AA，批號(hào)201213），室溫下于0、5、10、15、20、25 h 在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)羥基苯乙酮、6-芥子?；崽欠迕娣eRSD 分別為1.97%、1.98%，表明溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（生產(chǎn)企業(yè)AA，批號(hào)201213）6 份，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)羥基苯乙酮、6-芥子酰基蔗糖含量RSD 分別為1.52%、1.80%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知（對(duì)羥基苯乙酮5.98 μg/g、6-芥子?；崽?5.18 μg/g） 的本品（生產(chǎn)企業(yè)AA，批號(hào)201213） 9 份，每份約0.25 g，精密稱定，平均分成3 組，分別精密加入對(duì)羥基苯乙酮（1.99 μg/mL）對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL 及6-芥子?；崽牵?2.16 μg/mL） 對(duì)照品溶液0.5、0.6、0.8 mL，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.3.7 基質(zhì)效應(yīng)考察 精密吸取“2.1.1” 項(xiàng)下母液適量，分別用甲醇、缺白薇陰性樣品溶液稀釋成含對(duì)羥基苯乙酮0.019 9、0.398、1.99 μg/mL，6-芥子?；崽?.055 4、1.108、5.54 μg/mL 的溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果，不同質(zhì)量濃度對(duì)羥基苯乙酮基質(zhì)效應(yīng)分別為104.1%、100.5%、99.0%，6-芥子?；崽欠謩e為103.5%、100.3%、98.9%，表明其影響較小。

2.4 樣品含量測(cè)定 取31 家生產(chǎn)企業(yè)91 批樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。由此可知，有32 批樣品存在投料問(wèn)題，總不合格率為35.2%，來(lái)自14 家生產(chǎn)企業(yè)，占總數(shù)的45.2%； 投料情況分為4 種，分別為未投料 （1 批，占比1.1%）、正品投料 （59 批，占比64.8%）、摻雜投料（10 批，占比11.0%）、全偽投料（21批，23.1%），表明老瓜頭替代白薇投料是一種普遍現(xiàn)象，其原因可能是兩者性狀相近，極易混淆，部分生產(chǎn)企業(yè)藥材鑒定水平較低，無(wú)法分辨而導(dǎo)致誤買誤用，另外老瓜頭分布廣泛，資源豐富，價(jià)格低廉，也不排除部分生產(chǎn)企業(yè)存在為節(jié)約成本以其代替白薇投料的可能。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

各成分含量分布見圖2，可知對(duì)羥基苯乙酮含量分布較集中，表明正品投料時(shí)其差異較小，制劑質(zhì)量穩(wěn)定； 6-芥子酰基蔗糖含量差異較大，可能是由于老瓜頭摻偽量不同，或6-芥子?；崽窃诶瞎项^中含量差異較大所致。

圖2 各成分含量分布

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑50% 甲醇、70% 甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇，提取方式超聲、加熱回流，以及提取時(shí)間20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件為甲醇超聲提取30 min。另外，流動(dòng)相中加入適量乙酸銨可加強(qiáng)離子響應(yīng)，并且其效果優(yōu)于甲酸銨、甲酸、乙酸，但其濃度過(guò)大時(shí)會(huì)產(chǎn)生離子抑制效果，在1 mmol/L 時(shí)最佳。

對(duì)羥基苯乙酮作為白薇特征性成分，在廣東、四川、山東公布的白薇配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)中均有收錄； 6-芥子?；崽亲鳛槔瞎项^特征性成分，在文獻(xiàn)［20］ 中首次報(bào)道，研究表明該藥材冒充白薇經(jīng)原粉投料時(shí)，可通過(guò)液相色譜-紫外檢測(cè)器在女金丸中檢查出該成分。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，投料用的藥材經(jīng)提取后藥味較多，成分復(fù)雜，僅使用紫外檢測(cè)器時(shí)特征峰容易受到其他色譜峰的干擾，影響判定結(jié)果。

4 結(jié)論

為了避免檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性，增加檢查方法的專屬性、準(zhǔn)確性、靈敏性，提高特征性成分檢查的適用性，本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS 方法檢查小兒感冒顆粒中白薇投料情況，并且同時(shí)使用了白薇專屬性成分、混淆品老瓜頭標(biāo)志性成分，該方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確靈敏，兼顧定性、定量分析，能科學(xué)準(zhǔn)確地反映上述情況，并可為含白薇制劑的摻偽檢查提供參考。