曹 敏

（廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院有限公司，廣西 南寧 530031）

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，主要由兒茶素類、花色素類、花黃素類、縮酸、縮酚酸類物質(zhì)組成。其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯是兒茶素中含量最高、活性最強(qiáng)的成分，常占后者總量的50%［1］，具有特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)、很強(qiáng)的抗氧化活性，在抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗炎、抗病毒等方面有著出色表現(xiàn)［2-6］，尤其是在治療艾滋病方面，該成分能通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)對HIV 感染的抑制［7-9］，并且它可作為腫瘤多耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，改善癌細(xì)胞對化療的敏感性，并減輕對心臟的毒性［10］。

目前，表沒食子兒茶素沒食子酸酯高純品售價(jià)一直居高不下，主要是由于其生產(chǎn)成本過高，故需優(yōu)化其生產(chǎn)工藝以降低成本，從而更廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化妝品等行業(yè)。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大孔樹脂分離純化茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯工藝，以期為該成分進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Waters 515/2489 高效液相色譜儀，配置紫外吸收檢測器（美國Waters 公司）； VWD 紫外檢測器（美國安捷倫科技公司）； N4S 紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）； AP135W 分析天平（十萬分之一，日本島津公司）； ZHWY-211B 恒溫?fù)u床（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）； DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）； KQ3200DB 超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）； CCT-3300 超純水器（重慶力德高端水處理設(shè)備研發(fā)有限公司）； 玻璃層析柱（30 mm×600 mm，海門市三和新華玻璃試驗(yàn)儀器廠）。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品 （美國Cato Research Chemicals Inc 公司）； 98%茶多酚（四川暢維生物科技有限公司）。D101、HZ801、HZ816、HZ818 大孔樹脂（上海華震科技有限公司）； AB-8、X-5 大孔樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。甲醇為色譜純［默克化工技術(shù)（上海）有限公司］； 冰醋酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 其他試劑均為分析純； 水為高純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 在茶多酚粉末中加入適量純水或乙醇，50 ℃水浴10 min，制成相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即得。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取表沒食子兒茶素沒食子酸酯對照品4.88、3.90、2.93、2.20、1.10、0.55、0.28、0.14、0.07、0.03 mg，無水乙醇溶解并定容至5 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量測定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水-醋酸（24 ∶75 ∶1）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃；檢測波長276 nm； 進(jìn)樣量10 μL； 運(yùn)行時(shí)間14 min。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度（Y） 對峰面積（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.000 000 068X-0.000 79 （r＝0.999 95），在0.006～0.976 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 測定方法 取“2.1” 項(xiàng)下供試品溶液0.2 mL，無水乙醇定容至10 mL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量［12］，公式為含量＝C×V1×V2/V3，其中C為表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度，V1為供試品溶液總體積，V2為待測液體積，V3為供試品溶液取樣體積。

2.4 大孔樹脂篩選

2.4.1 預(yù)處理 各大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，先用洗脫液洗至加入純水不渾濁，再用純水洗至無醇味。另外，由于上述樹脂較干凈，并且結(jié)合廠家提供的預(yù)處理方法，故均不使用酸或堿進(jìn)行預(yù)處理，從而更環(huán)保。

2.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道，并根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。按“2.1” 項(xiàng)下方法制備含10%茶多酚的供試品溶液（表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為36.59 mg/mL），準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的6 種大孔樹脂各10.0 g （瀝干水分），置于錐形瓶中，加入30 mL 供試品溶液，封口，在恒溫?fù)u床（25 ℃、70 r/min） 上振蕩吸附4 h，取出，濾過，少量純水清洗表面附著的供試品溶液，合并濾液和清洗液，測定原液、合并液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量，計(jì)算吸附量、吸附率，公式分別為吸附量＝M1-M2、吸附率＝ ［（M1-M2） /M1］ ×100%，其中M1為原液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量，M2為合并液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量。吸附后的大孔樹脂用500 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯洗脫量，計(jì)算解吸率，公式為解吸率＝［M3/ （M1-M2）］ ×100%，其中M3為洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量。結(jié)果見表1。

表1 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

由此可知，弱極性大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附率、解吸率都比非極性大孔樹脂低，這可能與該成分具有一定極性，較難被弱極性大孔樹脂吸附，并且吸附后由于結(jié)合較牢，中等體積分?jǐn)?shù)（50%左右） 乙醇不易洗脫有關(guān)； X-5 吸附量雖然達(dá)740.96 mg，僅次于HZ816，但其解吸率僅為25.53%； HZ818 解吸率雖然達(dá)91.75%，但其吸附率僅為49.61%； HZ816 吸附率、解吸率最高，在很大程度上保證了表沒食子兒茶素沒食子酸酯回收率、樹脂使用壽命，故選擇其進(jìn)行后續(xù)考察。

2.4.3 靜態(tài)吸附動力學(xué)研究 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HZ816大孔樹脂10.0 g （瀝干水分），置于錐形瓶中，加入30 mL含10%茶多酚的供試品溶液，封口，在恒溫?fù)u床（25 ℃、70 r/min） 上振蕩吸附4 h，每20 min 取樣1 次，測定吸附前后表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量，計(jì)算樹脂對該成分的比吸附量［公式為比吸附量＝ （C0-C1） ×V/M，其中C0為吸附前供試品溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度，C1為吸附后供試品溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量，V為供試品溶液體積，M為大孔樹脂濕重］，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，比吸附量為縱坐標(biāo)繪制靜態(tài)動力曲線［13］，見圖1。由此可知，樹脂比吸附量在前30 min 內(nèi)升高程度較快，40 min 后趨于穩(wěn)定，基本達(dá)到吸附平衡。

圖1 靜態(tài)吸附動力曲線

2.5 分離純化工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn)

2.5.1.1 上樣量確定 準(zhǔn)確稱取HZ816 大孔樹脂80.0 g（瀝干水分） 共5 份，濕法裝入玻璃層析柱（30 mm×600 mm） 中，分別以10%、20%、30%、40%、50% 乙醇溶解茶多酚粉末，制成5%乙醇溶液（表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為20.93 mg/mL），以0.6 BV/h 速率上層析柱，收集流出液（5.0 mL/管），測定流出液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度，以流出體積為橫坐標(biāo)，流出液、上樣液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度的比值（C/C0） 為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)吸附穿透曲線，見圖2 （當(dāng)C/C0＝0.1 時(shí)，樹脂吸附達(dá)到滲透點(diǎn)［14-15］，此時(shí)應(yīng)停止上樣）。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，吸附能力越弱，滲透點(diǎn)越提前，這是由于乙醇具有一定的洗脫能力所致； 10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶解的供試品溶液達(dá)到滲透點(diǎn)時(shí)，流出體積分別為208、178、167、138、93 mL，比吸附量分別為54.42、46.57、43.69、36.10、24.33 mg/g。再以比吸附量平均值41.02 mg/g 為上樣量計(jì)算基數(shù)，為了保證分離效果，上樣量應(yīng)為樹脂用量的10%左右，故其計(jì)算公式為上樣量＝41.02×樹脂用量×10%。

圖2 動態(tài)吸附滲透曲線

2.5.1.2 洗脫體積確定 配制含10% 茶多酚的水溶液5份，每份3 mL，經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱（瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g），分別以20%、25%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫，洗脫速率為0.6 BV/h。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線［16］，結(jié)果見圖3。由此可知，洗脫至4.0 BV時(shí)除了25%乙醇未能完全洗脫表沒食子兒茶素沒食子酸酯外，其他體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫后該成分質(zhì)量濃度均為0，綜合考慮試劑節(jié)約及后續(xù)濃縮成本，洗脫體積以4.0 BV 為宜。

圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯洗脫曲線

2.5.1.3 茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 以30%乙醇為溶劑，配制5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20% 茶多酚乙醇溶液，分別取樣3 mL，經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱（瀝干水后樹脂質(zhì)量為100 g），以0.6 BV/h 速率洗脫，收集洗脫液（4 mL/管），洗脫體積為4.0 BV，測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度，再合并洗脫液，測定該成分質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫率，結(jié)果見圖4。

圖4 茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

“2.5.1.1” 項(xiàng)下結(jié)果顯示，30% 乙醇配制的供試品溶液比吸附量在43.69 mg/g 左右，而上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)茶多酚乙醇溶液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度分別為18.58、29.27、38.29、46.98、54.96、64.47、75.43 mg/mL。由此可知，表沒食子兒茶素沒食子酸酯質(zhì)量濃度低于43.69 mg/mL 時(shí)，樹脂吸附未飽和，純度、洗脫率隨著茶多酚質(zhì)量濃度增加而升高； 超過43.69 mg/mL 時(shí)，樹脂吸附飽和，未被吸附的溶液向下擴(kuò)散吸附，使得分離區(qū)產(chǎn)生交叉混合，純度、洗脫率隨著茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而降低。

2.5.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 配制10%茶多酚溶液9 份，每份3 mL，經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱（瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g），分別以20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%乙醇洗脫，洗脫速率為0.6 BV/h，洗脫體積為4.0 BV，收集洗脫液（4 mL/管），測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度，再合并洗脫液，測定該成分質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫率，結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

“2.5.1.2” 項(xiàng)下結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，洗脫越集中，濃度越高，后續(xù)濃縮越節(jié)能。由此可知，20% 乙醇無法洗脫； 25%乙醇洗脫時(shí)表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度雖然較高，但其洗脫率僅為30%左右； 乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時(shí)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度呈降低趨勢，在30% ～45%范圍內(nèi)更明顯，大于45%后趨于穩(wěn)定，而洗脫率在乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%后趨于穩(wěn)定。

2.5.1.5 洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響 配制10%茶多酚乙醇溶液（30%乙醇溶解），分別取樣3 mL，經(jīng)HZ816 大孔樹脂層析柱（瀝干水后樹脂質(zhì)量為80.0 g），4.0 BV 30% 乙醇分別以0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 BV/h 速率洗脫，收集洗脫液（4 mL/管），測定洗脫液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度，再合并洗脫液，測定該成分質(zhì)量濃度，計(jì)算洗脫率，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響

洗脫速率越大，洗脫時(shí)間、純化時(shí)間越短，但純度也會有所降低。由此可知，洗脫速率對表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度、洗脫率的影響較小，大于0.6 BV/h 后兩者基本趨于穩(wěn)定。

2.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、洗脫速率（C） 為影響因素，按L16（45） 正交表［17］進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表2。

表2 因素水平

再以表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度（X）、洗脫率（Y） 的綜合評分為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)合工藝特點(diǎn)，設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4，計(jì)算綜合評分，公式為綜合評分＝ （0.6X/98.48+0.4Y/95.98） ×100，并進(jìn)行直觀分析、方差分析［18］。

直觀分析（表3） 顯示，各因素影響程度依次為B＞C＞A； 最優(yōu)工藝為A3B2C2，即12.5%茶多酚乙醇溶液，上樣量41.02 mg/g，4.0 BV 30%乙醇洗脫，洗脫速率0.6 BV/h。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析（表4） 顯示，各因素影響程度依次為B＞C＞A； 因素A有顯著影響（P＜0.05），B、C無顯著影響（P＞0.05）； 最優(yōu)工藝為A3B2C2，與直觀分析結(jié)果一致。

表4 方差分析

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.5.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

2.6 樹脂使用壽命測試 采用模擬移動床連續(xù)分離技術(shù)，對表沒食子兒茶素沒食子酸酯進(jìn)行連續(xù)分離純化中試試驗(yàn)，歷時(shí)337 d、八千多個(gè)小時(shí)。到最后停機(jī)時(shí)，HZ816 大孔樹脂一次分離得到的表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度達(dá)95.11%，回收率達(dá)78.99%，充分證明了該樹脂具有優(yōu)越的分離性能、較長的使用壽命，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)旨在篩選出可將模擬移動床分離技術(shù)應(yīng)用于表沒食子兒茶素沒食子酸酯分離純化的大孔樹脂，它應(yīng)對表沒食子兒茶素沒食子酸酯有著高吸附率、高解吸率，一次分離純度高，使用壽命長。董海勝等［19］篩選出的ADS-7、NKA-Ⅱ大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附能力分別只有19.06、17.02 mg/g，雖然兩者解吸率較高（分別為88%、92%），但由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過高（分別為60%、70%），導(dǎo)致該成分一次分離純度只能達(dá)到67.9%，工業(yè)上需多步反復(fù)分離才能得到高純度，而且樹脂使用壽命未作進(jìn)一步研究，故無論是吸附能力，還是富集表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純度，這2 種樹脂都不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究最終篩選出的HZ816 大孔樹脂對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的吸附能力達(dá)41.02 mg/g，在單柱分離純化試驗(yàn)中可將該成分純度提高至93.13%，洗脫率達(dá)94.14%，一次性洗脫基本無殘留，在一定程度上保證了該樹脂可反復(fù)使用； 經(jīng)過連續(xù)337 d 的模擬移動床中試分離試驗(yàn)后，該樹脂仍可使表沒食子兒茶素沒食子酸酯純度達(dá)95.11%，結(jié)晶后產(chǎn)品純度達(dá)98.80%，一次分離回收率達(dá)78.99%，充分證明了其優(yōu)越的分離性能，而且吸附容量高（處理能力強(qiáng)），分離所用的乙醇體積分?jǐn)?shù)低（30%），最大程度降低了成本，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。