楊 淵，黃明進(jìn)*，王大昌，阮寶麗，楊秋悅，楊 洋，羅影子，覃玉強(qiáng)

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州大學(xué)石斛研究院，貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州創(chuàng)禾源農(nóng)業(yè)科技有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550025）

白及為蘭科白及屬植物，具收斂止血、消腫生肌的功效［1］。我國(guó)產(chǎn)有黃花白及、小白及、華白及、白及［2］。近年來(lái)白及的研究逐漸增多［3-7］，但由于缺乏基因組序列研究數(shù)據(jù)，白及的分子生物學(xué)研究水平進(jìn)展緩慢。白及的細(xì)胞遺傳學(xué)研究主要集中在染色體水平上，研究發(fā)現(xiàn)白及的染色體為二倍體，其中核型類型有中部（m）、近中部（sm） 和近端 （st） 著絲點(diǎn)，染色體核型有2B 和2C兩種［8-9］。

隨著二代Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)不斷的發(fā)展，大量藥用植物的全基因組測(cè)序也隨之開展，基因組組裝也由scaffold、contig 及染色體水平發(fā)展到目前的端粒到端粒（T2T） 的0 gap 水平［10-11］。在對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行denovo 基因組測(cè)序之前，對(duì)于沒(méi)有參考基因組的物種，通常會(huì)對(duì)該物種基因組大小，雜合度等信息進(jìn)行預(yù)估，根據(jù)基因組大小及復(fù)雜度來(lái)判斷測(cè)序數(shù)據(jù)的深度，組裝基因組的難易程度等，從而制定相應(yīng)的測(cè)序和分析策略，一般可通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)［12-13］和基因組survey 測(cè)序與K-mer 分析2 種方式［14-15］獲取該物種的染色體核型、基因組大小、復(fù)雜度及重復(fù)序列比例等信息。本研究以白及為材料，嘗試采用上述測(cè)序技術(shù)對(duì)白及進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析與基因組測(cè)序，以期為白及后續(xù)精細(xì)圖階段的文庫(kù)構(gòu)建及全基因組de novo 測(cè)序策略奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為白及分子生物研究的研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 白及采自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院石斛研究院白及資源苗圃，經(jīng)貴州大學(xué)趙財(cái)副教授鑒定為藥用植物白及Bletillastriata（Thunb.） Reichb.f.的干燥塊莖。

1.2 試劑 檸檬酸鈉 （批號(hào)D223BA0020）、MgCl2·6H2O （批號(hào)20191114）、碘化丙啶（批號(hào)550825）、無(wú)水乙醇（批號(hào)20220406）、MOPS （批號(hào) 0670200911）、RNAase （ 批號(hào) 20200318）、Triton X-100 （批號(hào)0694070511）、EDTA-2Na （批號(hào)20200303），由貴州創(chuàng)禾源農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.3 儀器 BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）； 5810R 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；PT-3502C 酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；DYY-6C 電泳儀、DYCZ-22A 水平電泳槽、DYCZ-24A 垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司）；制冰機(jī) （日本SANYO 公司）； C1000TMPCR 儀、Chemi DocTM凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 染色體核型檢測(cè) 以白及成熟種子作為外植體經(jīng)組織培養(yǎng)5 個(gè)月后，取組培苗根尖作為供試樣品。將裝有根尖的離心管放置于充氣罐內(nèi)，充入0.9～1.0 MPa N2O，靜置處理2 h，將90%預(yù)冷冰乙酸加入離心管內(nèi)，靜置處理10 min。完成固定后，將冰乙酸吸出，ddH2O 進(jìn)行2 次清洗。用刀片將根的根尖白色部分切下，放入裝有25 μL 酶液的0.5 mL 離心管中，在37 ℃水浴條件下酶解1 h。酶解結(jié)束后，用70%乙醇將根尖清洗3 次，并用解剖針將根尖在剩余酒精中充分破碎和振蕩，4 000 r/min 離心，將細(xì)胞離心至管底后，晾干。根據(jù)根尖數(shù)量，在離心管內(nèi)加入25 ～45 μL 冰乙酸，離心，充分振蕩混勻。將載玻片放置在預(yù)先濕潤(rùn)的盒子中，室溫保持在23 ℃左右，吸取8 μL 細(xì)胞懸浮液滴于載玻片正中間，立即蓋上蓋子，直到細(xì)胞散開，載玻片晾干后取出。將染色體標(biāo)本在顯微鏡下進(jìn)行觀察，采用雙色熒光原位雜交（FISH） 探針制備，使端粒與rDNA 原位雜交，并在高分辨率的熒光顯微鏡CCD 下拍照，進(jìn)行染色體核型的精準(zhǔn)分析。

2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)基因組大小 白及塊莖上萌發(fā)1 個(gè)月的嫩芽，經(jīng)液氮-80 ℃速凍后保存?zhèn)溆?。取嫩芽置預(yù)冷的mGb 解離液經(jīng)刀片切碎，靜置10 min，過(guò)濾得細(xì)胞核懸浮液，加預(yù)冷PI 和RNAase置冰上避光染色0.5 ～1 h，CPI、CRNAase分別為50 μg/mL［16-17］。以番茄種子萌發(fā)后1 個(gè)月長(zhǎng)出的嫩葉為內(nèi)參，在488 nm 波長(zhǎng)處藍(lán)光激發(fā)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，每次檢測(cè)收集10 000 個(gè)顆粒。變異系數(shù)小于5%。

2.3 Survey 分析白及基因組大小 植物白及嫩芽采集后用液氮速凍后使用提取試劑盒Qubit?dsDNA BRassay Kit 進(jìn)行提取，檢測(cè)基因組DNA 濃度、純度、完整性。檢測(cè)參數(shù)為膠濃度1%； 電壓150 V； 電泳時(shí)間40 min； 以M1λ-Hind Ⅲdigest，M2 D2000 作為Marker?；驕y(cè)序與K-mer 分析委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行Ilumina 雙端測(cè)序。公式為基因組大小＝總堿基數(shù)/平均測(cè)序深度＝總K-mer 數(shù)/平均K-mer 深度。

3 結(jié)果

3.1 白及染色體核型分析 白及染色體用DAPI熒光染色通常呈藍(lán)色熒光，選取染色體形態(tài)清晰、染色程度適中、并分散良好分裂相，通過(guò)對(duì)不同分裂相觀察（圖1） 初步確定均白及染色體數(shù)目為32 條。利用端粒重復(fù)序列探針對(duì)染色體雙色進(jìn)行熒光原位雜交，被染色的端粒在熒光顯微鏡下呈綠色。由圖2 可知，以兩端都有端粒為一條染色體，白及染色體長(zhǎng)度在1.0 ～4.5 μm 之間，根據(jù)Levan等［18］的染色體分類方法及Stebbins［19］核型分類的標(biāo)準(zhǔn)分類方法，白及主要為近中部（sm） 或近端部（st） 著絲粒染色體，基因組較小，核型類型為2C。白及18S rDNA 和5S rDNA 在染色體上的定位分析，由于染色體被染成藍(lán)色，經(jīng)Fluorescein-12-dUTP 標(biāo)記的18S rDNA 探針與染色體結(jié)合后，在顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，而經(jīng)Texas-Red-5-dUTP標(biāo)記5 SrDNA 在顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光。由圖3 可知，5S rDNA 在2 條染色體上有顯示較強(qiáng)的紅色熒光雜交信號(hào)，18S rDNA 在2 條染色體顯示較強(qiáng)的綠色熒光雜交信號(hào)； 根據(jù)染色體長(zhǎng)度、形狀等特征將其進(jìn)行同源染色體配對(duì)，其中5S rDNA 分布在13 號(hào)2 個(gè)同源染色體的間隙，18S rDNA 分布在2號(hào)色體短臂的核仁組織區(qū)。同時(shí)也證實(shí)了白及染色體為二倍體。

圖2 白及染色體端粒FISH 結(jié)果Fig.2 FISH results of telomere of Bletillae Rhizoma chromosome

圖3 白及染色體的rDNA FISH 結(jié)果Fig.3 The rDNA FISH results of Bletillae Rhizoma chromosomes

3.2 白及基因組大小檢測(cè)

3.2.1 流式細(xì)胞檢測(cè)白及基因組大小 番茄是茄科的模式植物，其全基因組大小為900 Mbp。本研究以番茄為對(duì)照，估算白及基因組的大小。由圖4可知，粒子團(tuán)明確、清晰且集中，表明該實(shí)驗(yàn)條件下樣品可良好區(qū)分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參番茄峰的熒光值為18.89，白及峰的熒光值為50.78，根據(jù)待測(cè)物種C 值計(jì)算公式為白及C 值＝番茄DNA 含量×白及的熒光強(qiáng)度/番茄樣品的熒光強(qiáng)度，測(cè)得白及的基因組大小為2.37 Gb，是番茄的2.69 倍。

圖4 白及C 值流式細(xì)胞分析圖Fig.4 C value of Bletillae Rhizoma by flow cytometry analysis

3.2.2 白及基因組Survey 測(cè)序與K-mer 分析 采集樣品為白及嫩芽，通過(guò)試劑盒提取DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得電泳圖譜（圖5）。電泳圖譜主帶清晰，無(wú)降解、輕度蛋白質(zhì)污染，且測(cè)得DNA總量為1.518 μg，總體積為60 μL，濃度CDNA為25.3 ng/μL，根據(jù)《DNA 測(cè)序樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，白及DNA 樣品質(zhì)量滿足建庫(kù)測(cè)序要求，且建庫(kù)成功率約為97.40%。

圖5 白及DNA 電泳圖譜Fig.5 DNA electrophoregram of Bletillae Rhizoma

基因組利用由華大基因在Illumina 兩端進(jìn)行雙端測(cè)序（PE ＝150） 得出61.06 Gb 原始數(shù)據(jù)，使用SOAPnuke （V 1.6.5） 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾掉低質(zhì)量、存在接頭污染和重復(fù)的數(shù)據(jù)，得到有效數(shù)據(jù)共60.1 1Gb，公式為有效數(shù)據(jù)比例＝（有效數(shù)據(jù)/原始數(shù)據(jù)） ×100%，有效數(shù)據(jù)比例越大，表明文庫(kù)質(zhì)量越好。白及的有效數(shù)據(jù)比例約為98.42%，表明白及的基因組DNA 測(cè)序質(zhì)量較優(yōu)，測(cè)序結(jié)果整體的可信度高。

基于K-mer 分析原理，選取17～31 K-mer 進(jìn)行分析。通過(guò)GenomeScope 軟件對(duì)17 ～31 K-mer 的頻譜進(jìn)行擬合，構(gòu)建k＝19 的K-mer 分布圖（圖6），進(jìn)行基因組大小、重復(fù)序列比率和雜合率的評(píng)估。

圖6 19-K-mer 分布曲線Fig.6 19-K-mer distribution curve

圖6 中，藍(lán)色柱子是K-mer 的觀測(cè)值； 橙紅色擬合線部分對(duì)應(yīng)著深度過(guò)低的K-mer，這些K-mer被認(rèn)為是測(cè)序錯(cuò)誤引入的； 黑色擬合線是除去被認(rèn)為是錯(cuò)誤的部分（橙紅色擬合線部分） 之后剩下的所有K-mer，這些被認(rèn)為是可靠的K-mer 數(shù)據(jù)；黃色擬合線被認(rèn)為來(lái)自基因組非重復(fù)區(qū)域的K-mer分布； 垂直的黑色虛線為預(yù)測(cè)最低深度峰的整數(shù)倍覆蓋度。經(jīng)擬合后發(fā)現(xiàn)，19-K-mer 分布曲線為非正常泊松分布，呈現(xiàn)雙峰分布，在10 和19 處各有一個(gè)峰，估測(cè)白及的為二倍體。平均K-mer 深度即主峰對(duì)應(yīng)的K-mer 深度為19，在主峰的前面期望深度的1/2 位置處有明顯的雜合峰，說(shuō)明該基因組有一定雜合度的雜合度，即深度出現(xiàn)在10 附近的K-mer 序列為雜合序列，經(jīng)過(guò)Genomescope 軟件進(jìn)行雜合度分析，得到白及基因組的雜合率約為1.099%。K-mer 深度出現(xiàn)在主峰對(duì)應(yīng)深度2 倍以上的序列為重復(fù)序列，即深度大于40 的K-mer 序列為重復(fù)序列，重復(fù)序列約占67.45%從測(cè)序數(shù)據(jù)中得得到K-mer 數(shù)為59 981 133 228 個(gè)，去除深度異常的K-mer 后得到25 277 266 個(gè)。根據(jù)K-mer 深度信息，基因組大?。娇侹-mer 數(shù)目/平均K-mer深度。估計(jì)基因組大小約為2.53 Gb，有效測(cè)序深度為23.73。

通過(guò)對(duì)調(diào)研圖文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，該物種基因組的GC 含量（DNA 中鳥嘌呤和胞嘧啶所占比例）約為36.1%，較為適中，即白及的GC 分布無(wú)明顯偏向性，不會(huì)影響調(diào)研圖分析的準(zhǔn)確性，調(diào)研圖結(jié)果可靠。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)白及為二倍體，染色體數(shù)目32 條，染色體類型主要為sm 和st 型，這前人的研究結(jié)果大致相同［8-9］。從核型上看，白及的核型為2C 型，根據(jù)Stebbins［19］對(duì)染色體核型分類1A ～4D 中，2C型相對(duì)其他已發(fā)現(xiàn)的2B 型白及種質(zhì)資源進(jìn)化程度較高。而相同倍性的不同白及種質(zhì)資源在核型分類上存在差異，其原因可能是由于不同種質(zhì)資源為適應(yīng)不同生長(zhǎng)環(huán)境而引起的進(jìn)化或?qū)嶒?yàn)等因素而引起的。

高等植物有45S rDNA 和5S rDNA 兩類［20］。18S rDNA 是45S rDNA 的一種，其定位位點(diǎn)主要在染色體的次縊痕部位，與隨體相連，一般認(rèn)為物種45S rDNA 的染色體雜交位點(diǎn)數(shù)與隨體數(shù)相同［21］，而5S rDNA 通常有位于染色體末端和同源染色體間隙兩種位點(diǎn)［22］。研究發(fā)現(xiàn)，白及在5S rDNA 和18S rDNA 各有1 對(duì)位點(diǎn)，分別位于同源染色體間隙和染色體斷臂末端，因此認(rèn)為白及染色體存在2個(gè)隨體，且45S rDNA 和5S rDNA 在白及染色體上不存在共定位現(xiàn)象。本研究獲得了白及基于5S rDNA 和18S rDNA 熒光原位雜交核型與同源染色體上的2 個(gè)隨體，可作為白及染色體識(shí)別的有效標(biāo)志。

流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果依賴于內(nèi)參物種準(zhǔn)確性，且難以預(yù)判物種復(fù)雜程度； Survey 分析則受到會(huì)受數(shù)據(jù)質(zhì)量、軟件及參數(shù)設(shè)置等測(cè)序過(guò)程影響。因此在預(yù)估基因組大小時(shí)往往會(huì)結(jié)合進(jìn)行判斷，可將物種大小定位在一定的范圍內(nèi)，現(xiàn)已用于地黃［23］、黃芪［24］等藥用植物的基因組估測(cè)。本研究以流式細(xì)胞術(shù)與Survey 分析相結(jié)合，估測(cè)白及的基因組大小范圍在2.37～2.53 Gb 之間。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得白及基因組大小略低于Survey 分析，其主要原因可能是流式細(xì)胞技術(shù)在測(cè)定基因組大小時(shí)會(huì)受到植物的不同部位、內(nèi)參物質(zhì)、處理環(huán)境與內(nèi)標(biāo)植物等因素影響。本研究以番茄為內(nèi)參，其基因組大小是白及的2.7 倍，差異較大，導(dǎo)致估測(cè)結(jié)果偏低，這與好好芭［25］、馬鞍藤［26］等預(yù)測(cè)的基因組大小結(jié)果相同。另外通過(guò)K-mer 分析得出白及基因組雜合度為1.099%，重復(fù)序列約67.45%，根據(jù)基因組雜合度分類，雜合度大于0.8%為高雜合基因組，重復(fù)序列比例大于50%為高重復(fù)基因組［27］。因此白及基因組被認(rèn)為是超高雜合、超高重復(fù)基因組。所獲得的白及基因組特征信息，既可對(duì)白及的物種起源研究和下一步的基因組學(xué)研究具有參考價(jià)值，同時(shí)將為后續(xù)白及全基因組測(cè)序、組裝、去冗余處理及精細(xì)圖譜繪制等工作提供參考。