程寧波，劉文君，羅京超，王正寬

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001）

水飛薊Silybummarianum（L.） Gaertn 是菊科水飛薊屬草本植物，原產(chǎn)于南歐、北非。水飛薊素是從水飛薊種子中提取的一類新型黃酮類化合物，具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保護(hù)心肌、抗血小板聚集、抗腫瘤等作用［1-2］。水飛薊素主要包括水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B、水飛薊寧、水飛薊亭［3-5］，這6種成分為歐洲藥典7.0 及美國(guó)藥典（USP32-NF27）水飛薊提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中水飛薊素含量測(cè)定的檢測(cè)指標(biāo)。水飛薊素可用乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑從水飛薊籽粕或水飛薊殼中提取，其中用乙醇從水飛薊殼中提取水飛薊素的提取率較高，且較其他溶劑綠色環(huán)保［6-9］。有文獻(xiàn)研究了不同提取條件對(duì)水飛薊賓的影響，結(jié)果表明，水飛薊賓對(duì)溫度比較敏感，溫度越高，變化越快，在堿溶液中不穩(wěn)定，在酸溶液中比較穩(wěn)定［10-11］。課題組在用95%、90%、85%乙醇提取水飛薊素時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取液在自然光條件放置時(shí)，其中水飛薊寧含量均逐漸降低。基于此，課題組對(duì)水飛薊殼90%乙醇提取液進(jìn)行光穩(wěn)定性考察，以期為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀（配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD 檢測(cè)器）、Aglient 1290 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備DAD 檢測(cè)器、Q-TOF 6538 質(zhì)譜儀）、Agilent C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm） （美國(guó)Agilent 公司）； Thermo U3000 型半制備液相色譜儀（配有二元梯度泵，柱溫箱、VWD 檢測(cè)器，美國(guó)Thermo 公司）； AL204 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；LHH-150GSP 綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（上海賽歐試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、無(wú)水乙醇、磷酸均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司； 水為超純水。

1.3 藥物 水飛薊殼（批號(hào)201129） 購(gòu)自盤錦格潤(rùn)生物有限公司，經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司王正寬工程師鑒定為正品。水飛薊寧對(duì)照品（批號(hào)141019） 購(gòu)自成都普菲德對(duì)照品科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動(dòng)相80% 甲醇 （含0.5% 磷酸）（A） -20%甲醇（含0.5%磷酸） （B），梯度洗脫（0～5 min，15%A； 5 ～20 min，15% ～18%A； 20 ～35 min，18% ～35%A； 35 ～60 min，35%A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm； 進(jìn)樣量2 μL。

2.2 供試品溶液制備 取水飛薊殼100 g，依次用4 倍量90%乙醇回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，過濾，將濾液分裝至10 mL 西林瓶中。取3組供試品溶液壓塞，軋蓋，分別置于室溫自然光照、室溫避光、強(qiáng)光照射保存； 另取3 組供試品溶液，第一組充入氮?dú)猓诙M充入空氣，第三組充入氧氣，壓塞，軋蓋，分別強(qiáng)光照射放置。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取水飛薊寧對(duì)照品約5 mg，置于10 mL 量瓶中，90%乙醇溶解并定容至刻度，混勻，0 ～4 ℃冰箱放置，備用。精密稱取對(duì)照品溶液適量用90% 乙醇稀釋，裝入10 mL西林瓶中，壓塞，軋蓋，強(qiáng)光照射放置。

2.4 光照前后的樣品比較 取供試品、對(duì)照品溶液適量，并分別強(qiáng)光照射2.5、5 d （穩(wěn)定性試驗(yàn)箱； 溫度25 ℃； 光源日光燈； 光照強(qiáng)度4 500 Lx），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，與未強(qiáng)光照射的供試品、對(duì)照品相比，兩者中的水飛薊寧含量在強(qiáng)光照射下發(fā)生降解，降解產(chǎn)物含量隨光照時(shí)間的增加而升高。

圖1 不同光照時(shí)間的樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of samples with different illumination time against lights

2.5 不同光照強(qiáng)度的樣品比較 分別取供試品溶液，以及其避光放置、自然光照、強(qiáng)光照射5 d 所得樣品，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖2。由此可知，與供試品溶液相比，溶液中的水飛薊寧在避光條件下放置5 d 穩(wěn)定性良好，色譜峰無(wú)明顯變化； 在自然光照和強(qiáng)光照射下發(fā)生降解，降解產(chǎn)物含量隨光照強(qiáng)度的增加而升高。

圖2 不同光照強(qiáng)度照射的樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of samples with different light intensity against lights

2.6 充入不同氣體的光照樣品比較 分別取供試品溶液，以及其充氮?dú)饨M、充空氣組、充氧氣組溶液分別強(qiáng)光照射5 d，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。由此可知，與供試品溶液相比，在強(qiáng)光照射5 d 后溶液中的水飛薊寧發(fā)生降解，降解產(chǎn)物含量隨溶液中含氧量的增加而升高。

圖3 充入不同氣體的光照樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of samples with adding different gas against lights

2.7 光照前后樣品的質(zhì)譜分析

2.7.1 質(zhì)譜條件 ESI 離子源，正負(fù)離子模式；干燥氣溫度350 ℃； 干燥氣流量10 L/min； 霧化氣壓力50.0 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 毛細(xì)管電壓（+） 4 000 V，（-） 3 500 V； 毛細(xì)管出口電壓135 V； 錐孔電壓65 V； 掃描范圍m/z100～1 500。

2.7.2 結(jié)果 分別取供試品溶液避光放置5 d、強(qiáng)光照射5 d 的樣品，在“2.7.1” 項(xiàng)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖4、表1。由此可知，供試品溶液強(qiáng)光照射樣品與避光樣品相比，色譜峰1、3 ～7的峰高及峰面積無(wú)明顯差異； 強(qiáng)光照射樣品的色譜峰2 降低，色譜峰8 升高，在光照條件下，色譜峰2 的化合物發(fā)生降解，降解產(chǎn)物為色譜峰8。

表1 化合物1～8 的二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片峰Tab.1 Compounds 1-8 secondary mass spectometry fragments of the main peak

圖4 不同光照強(qiáng)度照射樣品的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrograms of samples with different light intensity against lights

2.8 化合物8 的分離 取供試品溶液強(qiáng)光照射5 d的樣品減壓濃縮回收溶劑，干膏用甲醇溶解，經(jīng)半制備HPLC 純化，以甲醇-0.1% 甲酸水 （24% ～25.7%甲醇） 梯度洗脫（柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm），得到化合物8 （5.3 mg，tR＝15.5 min）。

2.9 化合物8 的結(jié)構(gòu)鑒定 白色無(wú)定型粉末，HR-ESI-MSm/z： 499.123 5 ［M+H］+，分子式C25H22O11，不飽和度 15。1H-NMR （400 MHz，CD3OD）δ： 6.88 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-2″），6.78 （1H，d，J＝8.1 Hz，H-5″），6.74 （1H，dd，J＝8.1，1.7 Hz，H-6″），6.28 （1H，s，H-6＇），5.96 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-8），5.94（1H，d，J＝2.1 Hz，H-6），5.11 （1H，d，J＝11.4 Hz，H-2），4.58 （1H，d，J＝11.4 Hz，H-3），4.22 （1H，dd，J＝9.3，5.2 Hz，H-γ），3.99 （1H，d，J＝2.6 Hz，H-2＇），3.97 （1H，d，J＝4.9 Hz，H-γ），3.86 （3H，s，3″-OCH3），3.52 （1H，d，J＝10.8 Hz，H-5＇），3.00 （1H，ddd，J＝12.3，6.8，5.3 Hz，H-β），2.84 （1H，dd，J＝12.5，10.9 Hz，H-α）；13C-NMR （100 MHz，CD3OD）δ： 198.0 （C-4），177.9 （C-3＇），176.3 （ C-4＇），168.7 （ C-7），165.2 （ C-5），164.3 （ C-9），149.2 （ C-3″），146.9 （ C-4″），133.1 （ C-1＇），133.0 （ C-1″），128.2 （ C-6＇），122.2 （ C-6″），116.4 （ C-5″），113.1 （ C-2″），101.5 （C-10），97.5 （C-6），96.4 （C-8），82.1（C-2），74.9 （C-3），70.3 （C-γ），56.4 （3″-OCH3），51.1 （C-5＇），43.5 （C-2＇），43.5 （Cα），41.3 （C-β）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為silyamandin。

3 結(jié)果與討論

水飛薊90%乙醇提取液的光穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，水飛薊寧在光照條件下不穩(wěn)定。水飛薊寧（色譜峰1） 含量與光照強(qiáng)度及氧氣含量成反比，而光降解產(chǎn)物（色譜峰2） 含量與光照強(qiáng)度及氧氣含量成正比。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，化合物1 ～7 的一級(jí)質(zhì)譜有著相同的準(zhǔn)分子離子峰m/z481 ［MH］-，這7 種成分的相對(duì)分子質(zhì)量均為482，且二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片離子峰與文獻(xiàn)［5，13-14］ 報(bào)道的基本一致，化合物1 ～7 分別為水飛薊亭A、水飛薊寧、水飛薊亭B、水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B?；衔? 在正離子模式下的質(zhì)譜峰m/z499.123 8 ［M + H］+，516.150 0 ［M + NH4］+，521.105 9 ［M + Na］+，1 019.223 5 ［2M+H］+； 負(fù)離子模式下的質(zhì)譜峰m/z497.107 2 ［M-H］-、995.223 8 ［2M-H］-； 化合物8 的分子量為498。文獻(xiàn)［15］ 發(fā)現(xiàn)了水飛薊賓或異水飛薊賓同分異構(gòu)體的氧化產(chǎn)物的質(zhì)譜峰m/z499 ［M+H］+，521 ［M+Na］+，分子量為498；本研究從供試品溶液光照氧化后的樣品中，分離得到化合物8，并通過核磁波譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，經(jīng)比較與文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道的從水飛薊酊劑中分離得到一個(gè)新化合物silyamandin 的氫譜、碳譜數(shù)據(jù)基本一致，因此確定化合物8 為silyamandin。

本研究結(jié)果表明，供試品溶液中的水飛薊寧在光照下與一分子O2發(fā)生氧化反應(yīng)并脫去一分子H2O 生成silyamandin［12］，而水飛薊亭A、水飛薊亭B、水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B 對(duì)光照均穩(wěn)定。水飛薊提取物中主要的黃酮木脂素化合物見圖5。

圖5 水飛薊提取物中主要的黃酮木脂素化合物Fig.5 Flavonolignans of Silybum marianum extract

水飛薊寧為水飛薊提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中水飛薊素含量測(cè)定指標(biāo)之一，具有較為顯著的抗光老化作用［16］。本研究的研究結(jié)果提示水飛薊提取物生產(chǎn)過程中應(yīng)避免光照，防止水飛薊寧發(fā)生降解； 同時(shí)為水飛薊寧光氧化產(chǎn)物silyamandin 的制備提供參考。課題組后續(xù)將對(duì)水飛薊寧光氧化產(chǎn)物的藥理活性進(jìn)行研究，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。