吳靜 趙妍 張珂 楊景 孟勝君

湖南省婦幼保健院婦科 （長沙 410000）

妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic neplasma，GTN）是胚胎滋養(yǎng)細胞異常增殖形成的腫瘤，是一種較為罕見的惡性婦科腫瘤疾?。?-2］。GTN的診斷和療效評估在大多數(shù)情況下是通過監(jiān)測血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）和組織學(xué)證據(jù)來進行的，但影響其水平高低的因素眾多［3］。特異性生物標志物越來越多的被用作鑒別診斷和預(yù)后評估，從而為GTN帶來不同的治療方案和預(yù)后［4］。既往研究缺乏時效性強且便捷的GTN預(yù)后評估方法，因此相關(guān)血清生物標志物的探討十分重要。WU等［5］研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）-200a在妊娠期高血壓疾病患者中表達上調(diào)，且可通過靶向下游基因促進滋養(yǎng)層細胞增殖、遷移和侵襲，抑制凋亡。既往研究顯示，miR-152表達增加可促進滋養(yǎng)層細胞的凋亡［6］。上述研究中miR-200a、miR-152均與滋養(yǎng)層細胞的生物學(xué)行為有關(guān)，但二者在GTN中的表達情況及臨床作用仍不十分明確。因此，本研究通過探究GTN患者化療期間血清miR-200a、miR-152的表達水平變化，以期為改善預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料樣本量計算：利用PASS15軟件進行樣本量計算，雙側(cè)檢驗，設(shè)OR= 2，α = 0.05，power = 90%，計算得到觀察組和對照組各79例，考慮可能有失訪人數(shù)，失訪率按20%計算，則觀察組和對照組至少需要95例。采用病例對照研究選取2019年6月至2022年12月期間本院就診且行甲氨蝶呤（MTX）方案方案化療的100例GTN患者為觀察組，選取同期體檢健康女性103例為對照組，對照組年齡、妊娠史與觀察組匹配。研究對象本人已提供知情同意書，本研究獲取醫(yī)院倫理委員會批準，倫理批號：2020-S037。

觀察組納入標準：（1）臨床特征、影像學(xué)檢查、病理診斷確診，符合其診斷標準［7］，既往均無妊娠期高血壓；（2）患者化療過程中依從性高，且無過敏反應(yīng)；（3）年齡≥18周歲，臨床資料完整；（4）精神狀態(tài)正常，可正常溝通交流。排除標準：（1）伴其他類型惡性腫瘤者；（2）免疫功能紊亂、臟器功能異常者；（3）合并其他可引起血清HCG水平異常的疾病者。對照組納入標準：年齡≥18周歲，臨床資料完整，體檢結(jié)果顯示體格健康，無GTN或其他器質(zhì)性疾病，精神狀態(tài)正常，可正常溝通交流。排除標準：已參加其他研究。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集收集GTN化療患者年齡（＜ 40歲，≥ 40歲）、收縮壓、舒張壓、距前次妊娠間隔時間（＜ 7個月，≥ 7個月）、前次妊娠性質(zhì)（足月妊娠，流產(chǎn)，異位妊娠，葡萄胎）、病灶數(shù)（＜ 5個，≥ 5個）、病灶直徑（＜ 5 cm，≥ 5 cm）、臨床分期（Ⅰ+Ⅱ，Ⅲ+Ⅳ）、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）預(yù)后評分（＜ 7分，≥ 7分）、化療前血HCG水平（＜ 10 000 U/L，≥ 10 000 U/L）。

1.2.2 血清miR-200a、miR-152表達水平檢測采集對照組體檢時及觀察組治療前、化療第1個療程、化療第3個療程空腹靜脈血樣5 mL，靜置離心（3 500 r/min，10 min）并收集上層血清，-80 ℃保存待測。采用Trizol試劑（上海齊源生物科技有限公司，貨號：QYK-12830）提取各血清樣本中總RNA，測定純度與濃度后，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：mlE6067）操作說明將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測血清miR-200a、miR-152表達水平，miR-200a上游引物5'-CGCATGCGCACTACTGACGAC-3'，下游引物5'-CTCTGTAGCGATCACGTCGTCG-3'；miR-152上游引物5'-CGCACGCTCTACGAGGA-CGA-3'，下游引物5'-TGAAGTAGTCGTACGCAGC-CT-3'；U6上游引物5'-GGACGTGGCGCTAGCGC-CA-3'，下游引物5'-CACGTCTGTACCACAGTCGA-C-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后采用2-ΔΔCT法計算血清miR-200a、miR-152的相對表達量。

1.2.3 療效評估及預(yù)后分組MTX方案，MTX 0.4 mg/（kg·d）肌內(nèi)注射，1次/d，連續(xù)5次；亞葉酸鈣0.1 mg/（kg·d）于MTX注射24 h后肌肉注射，1次/d，連續(xù)5次，療程間隔為2周，治療3個療程及以上。于化療3個療程后對患者進行評估，進展：病灶增大或轉(zhuǎn)移，血清HCG水平與治療前比較無顯著變化或呈升高趨勢；無變化：病灶縮小面積小于一半，血清HCG水平降低但仍處于異常情況；部分緩解：病灶面積縮小一半以上，血清HCG水平呈對數(shù)降低；完全緩解：各項臨床癥狀消失，血清HCG水平恢復(fù)正常。根據(jù)化療療效將患者分為預(yù)后良好組（完全緩解+部分緩解）80例和預(yù)后不良組（進展+無變化）20例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用IBM公司SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料經(jīng)檢驗后服從正態(tài)分布，采用（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，不同化療時間比較采用重復(fù)測量方差分析；計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預(yù)后不良的預(yù)測價值，曲線下面積（area under curve，AUC）比較行Z檢驗；GTN化療患者化療后預(yù)后不良與各指標的關(guān)系采用logistic回歸分析。P＜ 0.05則表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與觀察組血清miR-200a、miR-152表達水平比較觀察組血清miR-200a［（2.68 ± 0.62）vs.（1.02 ± 0.24）］表達水平高于對照組，miR-152［（0.68 ± 0.18）vs.（1.03 ± 0.22）］表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較隨化療時間延長，預(yù)后良好組與預(yù)后不良組血清miR-200a表達水平依次降低，miR-152表達水平依次升高（P＜ 0.05）。預(yù)后不良組治療前、化療第1個療程、化療第3個療程的血清miR-200a表達水平高于預(yù)后良好組，miR-152表達水平低于預(yù)后良好組（P＜ 0.05）。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，血清miR-200a、miR-152表達水平不同交互、時間及組間作用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

表1 GTN化療患者化療前后血清miR-200a、miR-152表達水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-200a and miR-152 expression levels before and after chemotherapy in GTN chemotherapy patients ±s

注：與同組化療前比較，aP＜0.05；與同組化療第1個療程比較，bP＜0.05

組別例數(shù)miR-200a/U6化療前2.61 ± 0.59 2.94 ± 0.64 F交互 = 61.173、F時間 = 42.990、F組間 = 26.479 P交互 ＜ 0.001、P時間 ＜ 0.001、P組間 ＜ 0.001預(yù)后良好組預(yù)后不良組F值P值80 20化療第1個療程2.21 ± 0.38a 2.54 ± 0.55a化療第3個療程1.82 ± 0.33ab 2.20 ± 0.40ab化療第1個療程0.82 ± 0.20a 0.55 ± 0.18a化療第3個療程0.97 ± 0.21ab 0.68 ± 0.17ab--miR-152/U6化療前0.74 ± 0.19 0.43 ± 0.16 F交互 = 16.880、F時間 = 24.531、F組間 = 106.537 P交互 ＜ 0.001、P時間 ＜ 0.001、P組間 ＜ 0.001

2.3 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預(yù)后不良的預(yù)測價值以化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯(lián)合預(yù)測概率值為檢驗變量，以GTN化療患者是否發(fā)生預(yù)后不良為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯(lián)合預(yù)測GTN化療患者預(yù)后不良的AUC分別為0.793、0.844、0.887，聯(lián)合預(yù)測AUC顯著高于單獨預(yù)測AUC（Z= 3.021、2.027，P＜ 0.05）。見圖1、表2。

圖1 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平預(yù)測GTN化療患者預(yù)后不良的ROC曲線Fig.1 Receiver operating characteristic of serum miR-200a and miR-152 expression levels predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients before chemotherapy

表2 化療前血清miR-200a、miR-152表達水平單獨及聯(lián)合預(yù)測GTN化療患者預(yù)后不良的價值Tab.2 Value of predicting poor prognosis of GTN chemotherapy patients with serum miR-200a and miR-152 expression levels before chemotherapy alone and in combination

2.4 GTN化療患者化療預(yù)后不良的單因素分析單因素分析結(jié)果顯示，預(yù)后良好組與預(yù)后不良組年齡、收縮壓、舒張壓、距前次妊娠間隔時間、前次妊娠性質(zhì)、病灶數(shù)、病灶直徑、臨床分期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。預(yù)后良好組與預(yù)后不良組FIGO預(yù)后評分、化療前血HCG水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 GTN化療患者化療預(yù)后不良的單因素分析Tab.3 Single factor analysis of poor chemotherapy prognosis in GTN chemotherapy patientsxˉ±s

2.5 GTN化療患者化療預(yù)后不良與各指標關(guān)系的logistic回歸分析以GTN化療患者化療后是否預(yù)后不良（是=1，否=0）為因變量，將單因素分析結(jié)果中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的miR-200a（連續(xù)變量）、miR-152（連續(xù)變量）、FIGO預(yù)后評分（≥ 7分 = 1，＜7分 = 0）、化療前血HCG水平（≥ 10 000 U/L = 1，＜10 000 U/L = 0）作為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-200a、miR-152、FIGO預(yù)后評分≥7分與GTN化療患者預(yù)后不良有關(guān)（P＜ 0.05）。見表4。

3 討論

妊娠滋養(yǎng)細胞疾病是胚胎滋養(yǎng)細胞進入子宮肌層后轉(zhuǎn)移至其它組織引起組織破壞或發(fā)生惡性增殖的一類婦科惡性腫瘤，包括良性葡萄胎和惡性GTN［8］。GTN包括絨毛膜癌、侵蝕性葡萄胎及中間型滋養(yǎng)細胞腫瘤等［9］。FIGO預(yù)后評分根據(jù)腫瘤侵犯的解剖部位將GTN患者進行危險分層，但其評分系統(tǒng)中關(guān)于低位分組范圍問題存在很大爭議［10］。

既往研究表明，miRNA在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括心血管疾病、腫瘤、內(nèi)分泌紊亂和妊娠相關(guān)疾病［11-14］。近期研究揭示了部分miRNA的異常表達對滋養(yǎng)層細胞的凋亡、增殖、侵襲及血管生成有重要影響［15，16］。miR-200a作為miR-200家族重要成員之一，可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移過程中起關(guān)鍵作用［17-19］。劉瑩等［20］研究顯示，miR-200a-3p可靶向轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白影響妊娠期高血壓疾病滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，GTN患者血清miR-200a水平高于健康女性。提示miR-200a高表達在GTN的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進作用，基于既往研究推測細胞內(nèi)環(huán)境被打破后，miR-200a表達水平出現(xiàn)顯著升高，miR-200a可通過影響細胞黏附、激活等作用參與GTN患者機體病理生理過程，尤其在細胞增殖和侵襲方面，與劉瑩等［20］研究結(jié)論相似。然而許多研究表明，miR-200a在多數(shù)腫瘤中表達下調(diào)，可抑制細胞增殖、遷移等生物學(xué)過程，發(fā)揮抑癌基因作用［21-22］。本研究結(jié)果與其結(jié)論相反，推測miR-200a在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮不同作用，有待相關(guān)基礎(chǔ)研究進一步驗證。近年來發(fā)現(xiàn)miR-152是miRNA家族中與細胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切的成員之一［23-25］。本研究結(jié)果中，GTN患者血清miR-152低表達。基于既往研究中miR-152與細胞生物學(xué)行為的關(guān)系推測：miR-152參與GTN滋養(yǎng)細胞惡性增殖的作用機制可能同樣與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，miR-152病理性低表達可能造成滋養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細胞，其細胞黏附功能及極性下降，惡性增殖、遷移及侵襲的能力增加。

此外，本研究結(jié)果中化療前血清miR-200a、miR-152表達水平對GTN化療患者預(yù)后不良有重要預(yù)測價值，經(jīng)化療治療后二者在不同預(yù)后患者中的表達水平趨勢不變。表明治療前miR-200a高表達、miR-152低表達可能影響治療GTN的療效和預(yù)后，臨床中可通過檢測治療前血清miR-200a、miR-152表達水平對患者預(yù)后進行及時預(yù)測，對于預(yù)測結(jié)果顯示為預(yù)后不良高危患者，可考慮從單藥方案轉(zhuǎn)為依托泊苷、MTX、Act-D、環(huán)磷酰胺和長春新堿聯(lián)合化療，甚至考慮行全子宮雙側(cè)輸卵管切除術(shù)。患者血清miR-200a高表達、miR-152低表達表明其腫瘤惡性風險較大，炎癥反應(yīng)大，滋養(yǎng)細胞惡性轉(zhuǎn)化能力強，進而影響化療療效，不利于預(yù)后。

綜上，血清miR-200a表達升高、miR-152表達降低可能不利于GTN化療療效提升，并提示GTN患者預(yù)后不良。本研究創(chuàng)新性：既往研究缺乏時效性強且便捷的GTN預(yù)后評估方法，而本研究以血清生物指標miR-200a、miR-152作為GTN化療預(yù)后的預(yù)測指標，其檢測快速便捷、時效性高、價格低廉，臨床醫(yī)生可通過早期密切觀察miR-200a、miR-152水平變化，將其作為依據(jù)有效地進行預(yù)后評估并選擇最佳的治療方案，提高受影響婦女的總體生存率。不足之處：本研究樣本較小，且預(yù)后不良與預(yù)后良好組病例數(shù)差異較大，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果可能存在偏倚。今后進一步的研究中將驗證miR-200a和miR-152作為預(yù)后標志物的效果，并建立獨立的驗證集來驗證二者預(yù)后價值；此外今后將通過更大樣本量的臨床研究及相關(guān)動物細胞實驗證實miR-200a表達升高、miR-152表達降低是否與滋養(yǎng)細胞增殖侵襲相關(guān)。