肖峰 姜錫男 舒露 石家齊 陳方敏 穆毅

1貴陽市第一人民醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550002）；2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科（貴陽 550001）；3天津市第三中心醫(yī)院泌尿外科（天津 300170）

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是全世界常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，每年有近38.6萬新發(fā)病例和15萬死亡病例［1］。在中國和美國，膀胱癌的發(fā)病率是泌尿系統(tǒng)腫瘤第1位，死亡率居第5位［2］。膀胱癌的發(fā)病率隨著患者年齡的增加而增加，男性約是女性的4倍［3］。膀胱癌分為非肌層浸潤性和肌層浸潤性膀胱癌兩類。非肌層浸潤性膀胱癌的典型治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術加膀胱灌注化療。肌層浸潤性膀胱癌患者通常接受根治性膀胱切除術和盆腔淋巴結切除術。非肌層浸潤性膀胱癌的5年生存率超過90%，復發(fā)率高達60%，約20%的患者處于進展期［4］。同時，大約一半的接收手術治療的患者出現(xiàn)復發(fā)或轉移。肌層浸潤性膀胱癌患者5年死亡率約為50%，局部進展或復發(fā)的患者預后更差。因此，尋找新型標志物預測膀胱癌復發(fā)及預后對其管理和治療至關重要。

細胞外基質蛋白1（extracellular matrix protein 1，ECM1）是一種在上皮中表達并分泌到細胞外基質的糖蛋白［5］。ECM1在乳腺癌、喉癌、肝癌、膽管癌、食管鱗癌、胃癌、結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達顯著增加［6-8］。此外，ECM1參與癌細胞增殖、血管生成、遷移和轉移等多種生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)ECM1表達增加促進多種癌癥的發(fā)生和轉移，并且ECM1過表達已被納入癌癥患者不良預后和轉移潛能的評分模型中［9］。先前研究［10］報道ECM1與膀胱癌細胞的生長、遷移和凋亡密切相關，但ECM1表達與膀胱癌患者臨床病理特征和預后的關系尚未有研究報道。因此，本研究通過對收治的膀胱癌患者作為研究對象，探討膀胱癌組織中ECM的表達與患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年12月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院行根治術治療的60例膀胱癌患者的癌組織及癌旁組織樣本。其中男22例，女38例；年齡33 ～ 73歲，平均（54.56 ± 8.62）歲。所有膀胱癌患者的病理類型由2名經(jīng)驗豐富的病理學醫(yī)生獨立診斷。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準。納入標準：（1）術后經(jīng)病理學鑒定為膀胱尿路上皮癌；（2）患者無放化療及膀胱癌靶向治療史；（3）臨床材料完整。排除標準：（1）存在免疫系統(tǒng)等疾病者；（2）有心肝脾腎功能障礙和驗證反復發(fā)作者；（3）有嚴重心臟疾病及認知功能損傷者；（4）有感染性疾病患者。

1.2 ECM1 mRNA表達檢測采用是是熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測ECM1表達。將收集的癌組織樣本和癌旁組織樣本中提取總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。對cDNA進行qRT-PCR進行定量分析，具體操作步驟設置：95 ℃ 30 s，95 ℃30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共設置40個循環(huán)。以GAPDH為內參。ECM1mRNA的相對表達量采用2-△△Ct方法計算。ECM1引物序列F：5'-CCTGGGCTGATCCACAACAT-3'；R：5'-TTGGCGTTCTCAGTGTCTCC-3'。GAPDH引物序列F：ACCCCGTGCTGCACCGAG-3'；R：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。

1.3 免疫組化法檢測ECM1表達情況收集癌組織樣本和癌旁組織樣本，用10%中性多聚甲醛固定，冰凍切片。用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟，浸泡15 min。在無水乙醇中水化2次。蒸餾水沖洗后，用PBS浸泡，檸檬酸鈉修復，10%山羊血清封閉，標一抗ECM1，洗滌后，標二抗，添加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素液。DAB顯色后，用自來水沖洗，封片，顯微鏡下觀察，拍照。根據(jù)染色強度對蛋白表達陽性、陰性評分。

1.4 隨訪術后通過電話訪問、門診復查等方式對所有患者進行隨訪，隨訪截止時間為2022年12月。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學差異分析。計數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差表示，組件比較采用獨立樣本t檢驗；Kaplan-Meier曲線分析ECM1表達與患者預后的關系；Cox風險比列回歸模型評估膀胱癌患者預后的影響因素。P＜ 0.05為代表數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECM1在膀胱癌組織及癌旁組織中表達的比較通過qRT-PCR檢測了60例膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中ECM1的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，根據(jù)ECM1表達的均值（2.03 ±0.21，P＜ 0.01），分為ECM1高表達組和ECM1低表達組，膀胱癌組織中ECM1的mRNA表達水平顯著增加。IHC染色結果發(fā)現(xiàn)癌組織中ECM1蛋白陽性率56.67%，癌旁組織中陽性率為13.33%，差異具有統(tǒng)計學意義，結果見表1、圖1。

圖1 膀胱癌和癌旁組織中ECM1的免疫組化檢測結果Fig.1 Immunohistochemical results of ECM1 in bladder cancer and paracancer tissue

表1 ECM1在膀胱癌組織和癌旁組織中表達Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

表1 ECM1在膀胱癌組織和癌旁組織中表達Tab.1 Expression of ECM1 in bladder cancer and adjacent tissues ±s

組別ECM1 mRNA ECM1 蛋白陽性［例（%）］癌組織4.96 ± 0.55 34（56.67）癌旁組織1.05 ± 0.04 8（13.33）t/χ2值78.32 24.76 P值＜ 0.05＜ 0.05

2.2 ECM表達在膀胱癌患者臨床病理特征中的比較ECM1在膀胱癌病理Ⅲ級、TNMⅢ-Ⅳ期、淋巴結轉移患者中表達顯著高于病理Ⅰ-Ⅱ級、TNMⅠ-Ⅱ期及無淋巴結轉移患者（P＜ 0.05）；ECM1表達在性別、年齡、吸煙史、肌層浸潤、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 ECM1表達在膀胱癌患者不同臨床病理參數(shù)中比較Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

表2 ECM1表達在膀胱癌患者不同臨床病理參數(shù)中比較Tab.2 The expression of ECM1 was compared in different clinicopathological parameters of bladder cancer ±s

項目性別男女年齡例數(shù)ECM1表達t值P值22 38 4.71 ± 0.43 4.75 ± 0.44 0.3421 0.7335＜ 50歲≥ 50歲吸煙史是否肌層浸潤是否病理分級Ⅰ-Ⅱ級Ⅲ級TNM分期Ⅰ-Ⅱ級Ⅲ級淋巴結轉移是否腫瘤大小≤ 3 cm＞ 3 cm 28 32 4.80 ± 0.40 4.78 ± 0.42 0.1881 0.8514 34 26 4.81 ± 0.46 4.86 ± 0.44 0.4507 0.6537 36 24 4.91 ± 0.50 4.89 ± 0.53 0.1482 0.8827 20 40 2.93 ± 0.51 4.95 ± 0.53 14.09 0.0010 26 34 2.74 ± 0.33 4.91 ± 0.50 19.15 0.0010 24 36 5.01 ± 0.47 2.51 ± 0.20 28.38 0.0010 30 30 4.67 ± 0.38 4.69 ± 0.39 0.2012 0.8413

2.3 ECM1表達與膀胱癌患者預后的關系所有患者隨訪3年，60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，總生存率為63.33%。ECM1高表達這3年生存率為47.06%（16/34），低于低表達者的84.62%（22/26）；ECM1高表達和低表達患者總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表達的膀胱癌患者預后更差，生存曲線見圖2。

圖2 ECM1高表達及低表達的生存曲線Fig.2 Survival curve of ECM1 with high and low expression

接下來，我們分析了TCGA-BLAC數(shù)據(jù)集中ECM1表達與患者的預后關系，結果發(fā)現(xiàn)ECM1高表達組的膀胱癌患者預后較ECM1低表達組的預后生存時間短，差異有統(tǒng)計學意義，結果見圖3。

圖3 基于GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫分析 ECM1高表達及低表達的生存曲線Fig.3 Survival curve of ECM1 with high and low expression based on GEPIA

2.4 Cox回歸分析影響膀胱癌患者預后的因素以膀胱癌患者預后為因變量，以ECM1高表達、病理分級Ⅲ、TNM分期、淋巴結轉移為自變量，進行多因素Cox回歸分析，結果顯示，ECM1高表達是影響膀胱癌患者預后的獨立危險因素（P＜ 0.001），見表3。

表3 影響膀胱癌患者預后的多因素Cox回歸分析Tab.3 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in patients with bladder cancer

3 討論

膀胱癌是全球第十大常見惡性腫瘤之一，每年導致約15萬例死亡。膀胱癌給各國社會經(jīng)濟帶來負擔，發(fā)病率和死亡率非常高。盡管在過去的幾十年里進行了大量的研究，取得了很大的進步，但5年生存率仍然不理想。因此，尋找與膀胱癌密切相關的生物標志物對其早期診斷及個體化治療具有重要意義。

ECM1最初于1994年被鑒定為一種大小為85 kDa的糖蛋白。目前，研究［11］表明ECM1參與多種生物學過程，如細胞增殖、血管生成、細胞凋亡、細胞遷移等過程。在大多數(shù)癌癥中，ECM1被發(fā)現(xiàn)促進癌癥的進展和侵襲，ECM1過表達被認為是不良預后的標志物，然而，關于ECM1在膀胱癌中的研究很少。本研究中，分析了60例旁觀癌患者癌組織和癌旁組織中ECM1的表達，發(fā)現(xiàn)ECM1在膀胱癌癌組織中表達顯著增加。這一結果與之前報道［12］的結果一致。同時，本研究發(fā)現(xiàn)ECM1在膀胱癌患者病理Ⅲ級、淋巴結轉移和TNM分期后期表達顯著增加，這結果說明ECM1表達與臨床病理相關。ECM1發(fā)揮癌基因的功能，與在肺癌和肝癌的研究結果［13］相似。因此，筆者認為ECM1是膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的關鍵調節(jié)因子。

先前的研究［14］顯示ECM1高表達與乳腺癌及肝細胞癌患者的不良預后相關；這提示ECM1高表達在膀胱癌患者是否影響患者的預后。本研究分析結果顯示：60例膀胱癌患者死亡22例，生存38例，總生存率為63.33%。ECM1高表達這3年生存率為47.06%（16/34），低于低表達者的84.62%（22/26）；ECM1高表達和低表達患者總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.262，P＜ 0.01），ECM1高表達的膀胱癌患者預后更差。進一步進行Cox多因素回歸分析，結果發(fā)現(xiàn)ECM1可以作為膀胱癌患者不良預后的獨立危險因素。

本研究存在一些局限性，僅僅分析了膀胱癌組織中的表達差異，沒有收集患者及健康人血液樣本進行分析。在未來的研究中將進行大樣本的分析及血液樣本中的研究。

綜上所述，膀胱癌組織中ECM1表達水平升高，與膀胱癌患者病理分級、TNM分期、淋巴結轉移及預后有關，同時ECM1為膀胱癌預后的獨立危險因素。