惠紅巖，周芳，周祥

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)學(xué)部1、神經(jīng)外科二病區(qū)2，河南 衛(wèi)輝 453100

卒中分為出血性卒中和缺血性卒中，后者是主要的卒中類型(占60%～80%)。腦血疏口服液說明書推薦適應(yīng)證中僅有出血性中風，無缺血性中風。齊江彤等[1]研究發(fā)現(xiàn)，腦血疏口服液對缺血性卒中的腦血流動力學(xué)、神經(jīng)功能、生活質(zhì)量、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、凝血功能均有改善作用；吳江瑩等[2]發(fā)現(xiàn)，腦血疏口服液對急性缺血性腦卒中患者的血脂、纖維蛋白原(FIB)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)改善顯著；作用機制尚不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討腦血疏口服液在缺血性卒中治療中的有效活性成分及作用機制等，為促進臨床合理用藥、增加缺血性卒中適應(yīng)證的可能性提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 有效化學(xué)成分收集、篩選 通過TCMSP及文獻收集所包含的7味中藥的化學(xué)成分[3-4]，并通過口服生物利用度(oral bioavailability，OB)(OB≥30%)和類藥性(drug likeness，DL)(DL≥0.18)進行篩選(水蛭除外)。

1.2 藥物活性成分靶點及疾病靶點分析 通過PubChem 和SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫獲得各成分對應(yīng)的靶點信息并進行過濾；通過HERB 數(shù)據(jù)庫獲得水蛭素靶點基因。通過GeneCards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，分別以“cerebral arterial thrombosis”、“ischemic stroke”為關(guān)鍵詞，獲得缺血性腦卒中相關(guān)的靶點基因，并進行去冗余。

1.3 “單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，篩選腦血疏口服液治療缺血性卒中的主要活性成分、作用靶點。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將獲得的作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件。

1.5 生物功能注釋與通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO功能注釋和富集分析。

1.6 有效成分-關(guān)鍵靶點分子對接分析 選擇最重要的候選活性化合物和靶點進行分子對接：(1)使用Chemoffice 15.1軟件將2D結(jié)構(gòu)以最小能量轉(zhuǎn)為3D結(jié)構(gòu)并導(dǎo)出；(2)應(yīng)用PyMOL2.5.1 軟件，進行氫化、受體蛋白脫水等初步處理；(3)利用AutoDock Vina1.1.2軟件，將蛋白受體與腦血疏口服液中的活性化合物的小分子配體對接。

2 結(jié)果

2.1 腦血疏口服液活性成分及靶點預(yù)測 得到腦血疏口服液7種單味藥的潛在活性成分及123個無冗余的藥物潛在靶點(除外無靶點者)，得到2 687個無冗余的缺血性腦卒中靶點。

2.2 “單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 將藥物潛在靶點和疾病相關(guān)靶點匹配分析取交集、剔除重復(fù)，最終得到共有靶點67個(圖1)。構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)(圖2)：將腦血疏口服液主要單味藥成分、活性化合物及67個共有靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到103 個節(jié)點，195 條邊，包括7 個單味藥，29 個活性成分(表1)，67 個作用靶點。每個活性成分平均與6.62個作用靶點相互作用，高于平均度值的活性成分有11 個，排名前6 的是山柰酚(kaempferol)、β-胡蘿卜苷(beta-daucosterol_qt)、胡蘿卜苷(Daucosterol_qt)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(betasitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，其度值分別為45、11、10、10、9、9；而牛膝和黃芪是度值最高的兩個單味藥，分別為10 和9。每個作用靶點平均與2.29 個活性成分相互作用，高于平均度值的靶點有16 個：NR1H3的互作活性成分最多，度值為11；CYP19A1、HMGCR、RORC 度值均為9；AR、CYP17A1、SREBF2 度值均為8。這些單味藥和活性成分可能是腦血疏口服液治療缺血性腦卒中中發(fā)揮重要作用的主要成分，而這些靶點可能是其主要作用靶點。

表1 腦血疏口服液7味中藥的29種活性成分Table 1 29 active ingredients in Naoxueshu oral liquid of 7 traditional Chinese medicines

圖1 韋恩圖Figure 1 Venn diagram

圖2 腦血疏口服液治療缺血性卒中的“單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 "Single drug-active ingredient-target"network of Naoxueshu oral liquid in the treatment of ischemic stroke

2.3 共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于STRING數(shù)據(jù)庫，對67個共有靶點進行PPI分析，導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。剔除孤立靶點，PPI網(wǎng)絡(luò)包含61個節(jié)點，平均度值11.31，度值大于均值的靶點22個：AKT1(48)、PTGS2 (33)、EGFR (31)、SRC (30)、ESR1 (28)、MMP9 (28)、IL2 (21)、KDR (20)、MMP2 (20)、AR (19)、PIK3R1 (19)、IGF1R (17)、GSK3B (16)、ABCB1 (15)、MET (15)、MPO (15)、PTK2 (15)、ABCG2 (14)、ESR2(14)、HSPA5 (14)、PTPN1 (14)、CYP19A1 (13)。這些靶點的相互作用可能是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Protein interaction network diagram

2.4 分子對接 分子對接山柰酚與PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點AKT1、PTGS2、EGFR、SRC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山柰酚與AKT1 的結(jié)合勢能最低(-9.3 kcal·mol)，其次是SRC (-9.1 kcal·mol)、PTGS2 (-8.6 kcal·mol)和EGFR(-7.8 kcal·mol)，見表2。山柰酚與以上四個靶點的分子對接結(jié)果進行可視化(當結(jié)合能≤-7.00 kcal/mol時，表明配體和受體蛋白間的結(jié)合活性很強[5-6]，見圖4。

表2 山柰酚與top 4靶點的分子對接Table 2 Molecular docking of kaempferol with top 4 target

圖4 山柰酚與核心靶點的分子對接Figure 4 Molecular docking of kaempferol with core targets

2.5 作用靶點的功能、通路的注釋與富集分析結(jié)果 對作用靶點進行功能、通路的注釋與富集分析，以期揭示腦血疏口服液在缺血性卒中治療中的可能機制，為臨床合理用藥提供支持。GO 注釋富集共得到3 413 個條目：與分子功能(MF)相關(guān)的有313 個，與細胞組分(CC)相關(guān)的有210 個，與生物過程(BP)相關(guān)的有2 890 個。分別選擇富集顯著性前20 的條目進行可視化(圖5A～5C)。在分子功能中，腦血疏口服液治療缺血性卒中功能主要集中在血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、鐵離子結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、氧化還原酶、單氧酶活動、絲氨酸水解酶活性、磷酸酶結(jié)合、激素結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、胰島素受體結(jié)合、類固醇結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性等(圖5A)；在細胞組分中，主要集中在囊泡腔、細胞質(zhì)囊泡腔、細胞膜組分、黏著斑等(圖5B)；在生物過程中，主要集中在細胞對化學(xué)成分的反應(yīng)、類二十糖苷代謝過程、調(diào)節(jié)體液水平、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等(圖5C)。KEGG 通路注釋與富集共得到165 個通路，選擇富集顯著性前20 的通路進行可視化(圖5D)，腦血疏口服液治療缺血性卒中的相關(guān)通路主要集中在內(nèi)分泌抗性、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性、雌激素信號通路、卵巢類固醇合成、PI3K-Akt 信號通路等。其中，雌激素信號通路和PI3K-Akt 信號通路的通路圖如圖6 和圖7 所示。

圖5 作用靶點的功能與通路富集分析Figure 5 Target function and pathway enrichment analysis

圖6 雌激素信號通路圖Figure 6 Estrogen signaling pathway

圖7 PI3K-Akt信號通路圖Figure 7 PI3K-Akt signaling pathway

3 討論

本研究系統(tǒng)分析了腦血疏口服液在缺血性腦卒中治療中的有效活性成分，構(gòu)建的“單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中包括7 個單味藥的29 個有效活性成分，起關(guān)鍵作用的單味藥主要是黃芪和牛膝，關(guān)鍵的活性成分是山柰酚、β-胡蘿卜苷等。

黃芪具有行滯通痹的作用，能補氣以行血，補氣以通痹，可以調(diào)節(jié)腦血管供血不足，對于痹癥、中風后遺癥等有一定的治療作用。其活性成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芪甲苷等通過作用于細胞凋亡等方面的靶點，干預(yù)細胞凋亡、內(nèi)皮血管生成，激活補體等疾病代謝途徑，促進神經(jīng)元修復(fù)，在缺血性腦卒中的預(yù)防和治療中，作用良好[7-8]。牛膝的功效有逐瘀通經(jīng)，引血下行等，還具有對神經(jīng)細胞的保護作用[9]。

黃芪、牛膝、牡丹皮、石菖蒲中均含有的山柰酚，是一種具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等作用的化合物[10-12]。山柰酚能夠減輕腦卒中后的梗死面積，預(yù)防給藥能有效改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，具有潛在的預(yù)防和治療卒中的作用[13-14]。牛膝中含有β-胡蘿卜苷，大黃中含有胡蘿卜苷，胡蘿卜苷可以上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD2)等的mRNA 水平，還能提高HO-1 的蛋白含量[15]，進而提高氧和葡萄糖剝奪及模擬再灌注處理后的皮層神經(jīng)元的存活率等，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16-17]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的山柰酚、β-胡蘿卜苷等可能的活性作用，與上述文獻報道一致。

該藥在缺血性卒中的治療中，涉及多個靶點，共有靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和“單味藥-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)提示，AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等靶點在缺血性卒中的預(yù)防和治療過程中，可能發(fā)揮著重要的作用。AKT1在缺血腦復(fù)灌時，磷酸化Akt明顯高表達[18]。非受體酪氨酸激酶SRC 參與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括基因轉(zhuǎn)錄、黏附調(diào)節(jié)、細胞增殖和血管生成等，與缺血性卒中中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的血管通透性增加和小鼠永久性局灶性腦缺血后的腦損傷相關(guān)[19-20]。PTGS2能夠參與介導(dǎo)腦缺血后的炎性反應(yīng)[21]。EGFR 有助于副炎性調(diào)節(jié)異常，與心血管功能障礙和重塑、腦損傷相關(guān)[22-23]。因此，腦血疏口服液中的活性成分可能是通過作用于以上靶點起治療作用。此外，在分子對接分析中發(fā)現(xiàn)，山柰酚與AKT1、SRC、PTGS2和EGFR具有較好的結(jié)合能力，說明關(guān)鍵活性成分山柰酚通過與這些靶點結(jié)合發(fā)揮作用可能是腦血疏口服液治療缺血性卒中的重要機制之一。

將以上靶點進行GO功能和富集分析，共得到165個通路，涉及多個生物過程與分子功能。PI3K-Akt信號通路是參與缺血性卒中后細胞凋亡的重要信號傳導(dǎo)通路，激活該信號通路，可對急性腦梗死后腦損傷起到保護作用[24]。如前所述，EGFR與腦損傷相關(guān)，推測腦血疏口服液的活性成分可能通過EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性通路發(fā)揮一定作用。缺血性腦卒中的發(fā)生中，首要原因是動脈粥樣硬化引發(fā)頸動脈狹窄而導(dǎo)致，而該進程是由AGE-RAGE 信號通路參與的[25]，AGE-RAGE信號通路中也有5個靶點基因富集。

綜上所述，本研究預(yù)測了腦血疏口服液中包括山柰酚、β-胡蘿卜苷、胡蘿卜苷等在內(nèi)的多種活性成分，作用于AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等多個靶點，調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激應(yīng)答、VEGF 信號通路、激酶活性等多種通路或生物過程、功能，通過多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)防治缺血性卒中的分子機制，為其增加缺血性卒中這一臨床適應(yīng)證的可能性，提供理論依據(jù)，相關(guān)結(jié)果仍需進一步驗證及臨床研究來證實。