秦天歌，周揚，韓露，張霞，陳維玲，李建紅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

黃褐斑是一種常見的難治性面部色素沉著性皮膚病，現(xiàn)存最早的與黃褐斑有關(guān)的描述見于戰(zhàn)國時期的《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·至真要大論篇》[1]：“歲陽明在泉，燥淫所勝……甚則嗌干面塵，身無膏澤”，將黃褐斑稱之為“面塵”。中醫(yī)將黃褐斑又稱之為“黧黑斑”“肝斑”等[2]。此病發(fā)于面部，頑固難愈，影響外觀，常對患者的自我認知、人際交往及工作等方面造成負面影響。

目前黃褐斑的臨床治療方法有口服系統(tǒng)藥物、外用局部色素減退劑、化學(xué)剝脫及激光治療等，多以單一或多種外用方法聯(lián)合口服藥物治療，輔以激光治療[3-4]。中醫(yī)認為本病與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切，肝郁、脾濕、腎虛皆為發(fā)病之根，氣血瘀滯、絡(luò)脈不通、顏面失于濡養(yǎng)為病機之關(guān)鍵[5]。中醫(yī)外治療法可直達病所，治療黃褐斑往往收效甚佳，且用法相對安全，患者接受度較高。本研究通過整理中醫(yī)古籍中黃褐斑外用方劑，進一步建立現(xiàn)代臨床中基于古方黃褐斑外用方藥數(shù)據(jù)庫，進行數(shù)據(jù)聚類分析和藥理機制研究，探討中醫(yī)外治法治療黃褐斑的用藥規(guī)律及機制，為黃褐斑外用方劑提供分子機制層面的參考依據(jù)，為臨床遣方用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源與檢索方式

1.1.1 古籍資料 以《中華醫(yī)典》（第5 版）[6]為檢索源，以“黃褐斑”“面塵”“面皯”“面黑皯”和“皯黯”為關(guān)鍵詞進行檢索，對條文進行合并刪重及詳細記錄。

1.1.2 臨床相關(guān)文獻 所有文獻來源于中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫（Wanfang Data）、維普中文期刊數(shù)據(jù)庫（VIP），以“黃褐斑”“肝斑”“蝴蝶斑”“妊娠斑”“黧黑斑”“面塵”“外用”和“外治法”等為主題詞進行交叉檢索，所收集文獻截止時間為2020 年11 月31 日，并對文獻進行合并刪重及詳細記錄。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 古方納入和排除標準 納入標準：①條文中包含明確說明用于治療黃褐斑的外用處方；②方劑記錄詳細齊全。排除標準：①重復(fù)出現(xiàn)的方劑只記錄1 次；②方劑藥物組成不完整。

1.2.2 現(xiàn)代臨床文獻納入和排除標準 納入標準：①中藥或中西醫(yī)結(jié)合外用治療黃褐斑的隨機對照研究、醫(yī)案報道、臨床觀察等研究；②外用方劑與上一步整理古方相關(guān)；③藥物組成明確。排除標準：①重復(fù)發(fā)表的臨床文獻只記錄1 次；②受其他藥物影響，無法明確判斷為中藥療效的臨床研究。

1.3 名詞術(shù)語標準化 將納入的外用方劑進行整理，并對藥物名稱進行統(tǒng)一規(guī)范。忽略具體治療方法，如糊劑、搽劑、熏蒸、外敷、敷貼等，將中藥復(fù)方拆解轉(zhuǎn)換為具體中藥。中藥名稱規(guī)范標準參照2015版的《中華人民共和國藥典》[7]，該版本藥典未收錄的藥物名稱，參考2006 年版的《中藥大辭典》[8]，若仍未收錄則沿用原始數(shù)據(jù)名稱。

1.4 數(shù)據(jù)錄入及分析 基于中醫(yī)傳承計算平臺（V3.0）軟件（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所）進行數(shù)據(jù)的錄入、建庫及分析，將臨床文獻整理匯總的處方相關(guān)信息以雙人雙機方式錄入并進行審核，保證數(shù)據(jù)錄入的準確性，建立黃褐斑外用方藥數(shù)據(jù)庫。

運用中醫(yī)傳承計算平臺（V3.0）軟件，錄入文獻中的方藥信息，在此基礎(chǔ)上建立數(shù)據(jù)庫，結(jié)合處方數(shù)量以及臨床經(jīng)驗，選擇“方劑分析”，設(shè)置支持度為30、置信度為0.8，獲取關(guān)聯(lián)規(guī)則及核心藥物組合。使用平臺數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，基于k 均值聚類算法及回歸模型對黃褐斑外用方劑進行聚類分析，獲得核心組合，進一步對黃褐斑外用方劑的藥物規(guī)律進行歸納總結(jié)。

1.5 疾病-靶點-通路-核心藥物-有效成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.5.1 核心藥物的有效成分篩選及其作用靶點獲取 依據(jù)聚類分析結(jié)果，選取12 味核心藥物作為現(xiàn)代臨床中醫(yī)外治黃褐斑的核心藥物。使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），分別檢索 “白芷”“白術(shù)”“茯苓”“白附子”等，根據(jù)該數(shù)據(jù)庫提供的設(shè)置“藥物相似度（Drug-likeness，DL）≥0.18”篩選出符合條件的候選活性成分，并結(jié)合化學(xué)結(jié)構(gòu)網(wǎng)、化源網(wǎng)、Drugbank、Batman-TCM 等藥物數(shù)據(jù)庫及文獻檢索，將不符合篩選參數(shù)，但有明確藥理作用的活性成分補充進TCMSP 篩選結(jié)果。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取以上活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點，在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中將靶點進行規(guī)范。

1.5.2 黃褐斑相關(guān)靶點的獲取 以“Melasma”“Chloasma”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）等疾病基因數(shù)據(jù)庫進行檢索。同時在基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中以“Melasma”“Chloasma”為關(guān)鍵詞檢索，得到GPL570 [HG -U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 平臺中相關(guān)蛋白芯片Series GSE7214，ID：200072140，對疾病靶點進行補充。將所有獲取的靶點進行匯總及去重，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對所得靶點進行標準化，得到所有疾病靶點。

1.5.3 基因功能和通路富集分析 使用R 語言（https：//www.r-project.org）將核心藥物有效成分靶點與黃褐斑靶點取交集并繪制韋恩圖。使用R 語言的“clusterProfiler”“bioconductor”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”安裝包對核心藥物和黃褐斑交集靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析及可視化。

1.5.4 “疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 根據(jù)上述所得到的核心藥物潛在活性成分與作用靶點之間的關(guān)系，利用Cytoscape 3.7.2 軟件建立疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 古籍黃褐斑外用方劑藥物統(tǒng)計 檢索《中華醫(yī)典》[6]得到474 條相關(guān)條文，經(jīng)納入和排除標準篩選后得到151 條條文，包含方劑37 首，涉及中藥78 味，藥物累計頻次177 次。用藥頻率前5 位為茯苓、白芷、白附子、防風和苦杏仁，藥物四氣統(tǒng)計以溫、平、寒性為主，藥物五味統(tǒng)計以辛、甘、苦味為主。

2.2 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑藥物統(tǒng)計與分析

2.2.1 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑藥物統(tǒng)計 依據(jù)文獻納入和排除標準篩選得到文獻424 篇，納入中藥復(fù)方309 個，涉及中藥232 味，藥物累計頻數(shù)2 222次，其中使用頻數(shù)≥50 次的藥物11 味，前5 位依次為白芷、茯苓、當歸、白及和白附子，見表1。四氣頻數(shù)前3 類為溫（950 次，46.7%）、寒（574 次，28.2%）、平（433 次，21.3%）；五味頻次前3 類為甘（930 次，30.9%）、辛（890 次，29.6%）、苦（882 次，29.3%）；歸經(jīng)頻數(shù)前3 類為肝（1 190 次，22.3%）、胃（938 次，17.5%）、肺（927 次，17.3%），見圖1。藥物功效統(tǒng)計示以補虛類、解表類、活血化瘀、平肝息風類藥物為主。

圖1 黃褐斑外治方藥的四氣、五味、歸經(jīng)統(tǒng)計

表1 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑中使用頻數(shù)≥50 次的藥物

2.2.2 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的方劑組方規(guī)律分析 設(shè)置支持度個數(shù)為30，置信度為0.8（支持度：表示藥對、三味藥物及多味藥物同時在至少30 首方劑中出現(xiàn)過；置信度：表示前后藥物組合同時配伍出現(xiàn)的關(guān)聯(lián)概率至少為80%）。

（1）藥物組合頻次分析：關(guān)聯(lián)規(guī)則分析獲得59 條藥物組合，涉及12 味中藥。高頻藥物組合有“白芷-茯苓”（111 次）、“白芷-白附子”（107 次）、“白芷-白及”（106 次）等，按照出現(xiàn)頻數(shù)從高到低依次排序，前10 組藥物組合見表2。

表2 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑中出現(xiàn)頻次前10 組藥物

（2）藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則分析：關(guān)聯(lián)分析獲得22 條藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則，根據(jù)置信度由高到低排序，前3 組的關(guān)聯(lián)規(guī)則為 “白及-白蘞->白芷”（置信度0.90）、“茯苓-白附子-僵蠶->白芷”（置信度0.89）、“茯苓-白及-僵蠶->白芷”（置信度0.88）、“白蘞->白芷”（置信度0.88）等，前10 組藥物組合見表3。使用中醫(yī)傳承計算平臺中“網(wǎng)絡(luò)展示”功能，對藥物-藥物關(guān)系進行網(wǎng)絡(luò)可視化操作得到核心網(wǎng)絡(luò)拓撲圖，見圖2，包含12 味核心藥物，見表4。

圖2 12 味核心藥物網(wǎng)絡(luò)拓撲圖

表3 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑中置信度前10 組藥物組合

表4 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑中核心藥物分類

2.2.3 k 均值聚類算法聚類分析 基于k 均值聚類算法與回歸模型對藥物進行聚類分析，將治療黃褐斑的外用藥物分為4 類，常用的配伍組合包括白芷-茯苓-當歸-白及，白芷-白附子-白及-僵蠶等，聚類分析結(jié)果見表5。

表5 現(xiàn)代臨床黃褐斑外用方劑中核心藥物組合

2.3 藥物-疾病交集靶點 篩選后得到核心藥物靶點347 個，黃褐斑疾病靶點476 個，將藥物靶點與疾病靶點匹配后得到18 個交集靶點基因如PTGS2、ESR1、NOS2，見表6。

表6 12 味核心藥物與疾病黃褐斑的18 個交集靶點

2.4 疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對18 個交集靶點進行富集分析，得到GO富集46 個，KEGG 通路19 條。GO 富集結(jié)果顯示，核心藥物-黃褐斑-基因的生物功能顯著富集在核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、氧化還原酶活性、類固醇結(jié)合等方面，根據(jù)顯著性程度排序，取前20 進行部分展示，見圖3。KEGG 富集結(jié)果顯示，與黃褐斑相關(guān)靶點的主要富集在小細胞肺癌、視黃醇代謝、化學(xué)致癌作用、甲狀旁腺激素的合成分泌和影響等信號通路，提示核心藥物可能是通過上述通路影響黃褐斑的治療效果，見圖4。

圖3 疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分GO 功能富集分析

圖4 疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分KEGG 通路富集分析

運用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分”網(wǎng)絡(luò)，見圖5。圖中共包含276 個節(jié)點（1 個深紅色節(jié)點代表疾病，18 個紫色節(jié)點代表交集靶點，19 個黃色節(jié)點代表疾病相關(guān)通路，12 個綠色節(jié)點代表核心藥物，22 個粉紅色節(jié)點代表各藥物之間重復(fù)活性成分，編號為A1～R1，204個黃色系節(jié)點代表藥物活性成分，且顏色由淺到深，不同顏色對應(yīng)不同的藥物）和879 條邊，每條邊代表潛在活性成分與作用靶點之間有相互作用關(guān)系。藥物-疾病交集靶點中與有效成分聯(lián)系密切的有PTGS2、PGR、ESR1、NOS2 和AR 等，見圖5。

圖5 疾病-交集靶點-通路-核心藥物-有效成分網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

黃褐斑色素沉著主要與黑色素合成增多、黑色素細胞數(shù)量增加以及黑色素分布相關(guān)[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃褐斑的病因主要與遺傳易感性、紫外線輻射、性激素、甲狀腺疾病及炎性反應(yīng)等方面相關(guān)[10]。目前中醫(yī)藥調(diào)控黃褐斑的作用機制研究主要涉及抑制黑色素、抗氧化、改善局部微循環(huán)等方面[11-12]。

中醫(yī)治療黃褐斑主要以理氣活血、活血化瘀和祛瘀通絡(luò)為法，本研究使用k 均值聚類算法與回歸模型對治療黃褐斑的藥物進行聚類分析，歸納出4個類方組合，第一類：白芷、茯苓、當歸和白及；第二類：白芷、白附子、白及和僵蠶；第三類：當歸、川芎、白芷和白及；第四類：桃仁、白芷、當歸和僵蠶。白芷辛溫解表，茯苓利水滲濕，白術(shù)益氣燥濕，當歸補血活血，川芎活血行氣，桃仁、白及活血化瘀，白附子解毒散結(jié)，僵蠶化痰通絡(luò)。通過聚類分析可見各類方藥組合雖功效有所不用，但都包含了活血化瘀、益氣行氣及化痰祛瘀之品，為中醫(yī)臨床治療黃褐斑提供了一定的參考。

本研究基于關(guān)聯(lián)規(guī)則獲取的12 種核心藥物主要為活血化瘀類、平肝息風類、補虛類藥物，在藥理作用上，白芷、茯苓、白術(shù)、白蘞和白附子中有效成分可抑制酪氨酸酶（TYR）活性，從而抑制黑色素生成，淡化色斑；川芎、當歸、紅花和白附子可活血化瘀，通過促進外周血管擴張、增加血流量、抑制血小板活性聚集等作用，改善局部微循環(huán)；丹參和僵蠶還可降低血液黏稠度，改善局部血管淤血狀態(tài)；白蘞、白及和珍珠中有效成分有抗氧化活性，可有效清除自由基，從而減少色素沉著的產(chǎn)生。

現(xiàn)代研究表明，L-酪氨酸作為黑色素生成的原始底物，經(jīng)TYR 催化形成多巴，并經(jīng)過多層反應(yīng)形成黑色素，因此TYR 在黑色素生成過程起限速作用[13]，其表達和活性影響黑色素生成的速度與產(chǎn)量。視黃酸可降低TYP 和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1（TRP-1）的表達，并通過逆轉(zhuǎn)紫外線刺激對TRP-2 的抑制作用，進而抑制黑色素生成，在此過程中對TYR 活性進行雙向調(diào)節(jié)[14]。同時視黃酮，即視黃醇結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)層和滲透性屏障的改變也可能促進表皮滲透，增加生物利用度，從而影響色素沉著的發(fā)生。本研究中與視黃醇相關(guān)的靶點及通路類視黃醇X 受體α（RXRA）、類視黃醇X 受體β（RXRB）、類視黃醇X 受體γ（RXRG）、視黃醇代謝與相關(guān)研究有一致相關(guān)性[15]。

現(xiàn)代研究表明，環(huán)磷酸腺苷（cAMP）依賴信號通路、Wnt 依賴信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是黑色素生成的重要相關(guān)通路[16]。本次研究得到的交集靶環(huán)氧合酶-2（COX-2）[15]、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）[18]可通過調(diào)控α-促黑色素細胞激素（α-MSH）的表達從而上調(diào)cAMP，激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（CREB1）的轉(zhuǎn)錄。α-MSH 是cAMP 依賴信號通路中的重要上游因子，可調(diào)控黑色素的生成。CREB1 是環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的重要亞型，cAMP 通路中磷酸化的CREB 可誘導(dǎo)下游小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）的表達，促進黑色素生成[19]。黑色素表達通路中α-MSH、CREB 與下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT 軸）之間有相互作用[20]，HPT 軸中瘦素激活原阿黑皮素（POMC）基因表達衍生的α-MSH 成為間接調(diào)節(jié)TRH 表達的候選基因。同時，異源細胞系統(tǒng)體外研究表明，α-MSH 通過黑皮質(zhì)素受體-4（MC4-Rs）傳導(dǎo)后經(jīng)過CREB 的磷酸化和結(jié)合可激活促甲狀腺激素釋放激素（TRH）啟動子[21]。本研究結(jié)果中的甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用通路（Parathyroid hormone synthesis，secretion and action）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）、甲狀腺癌通路（Thyroid cancer）與HPT 軸相關(guān)，這與現(xiàn)有研究中黃褐斑與甲狀腺疾病的相關(guān)性相印證，但甲狀腺激素和甲狀腺自身免疫對黃褐斑發(fā)病機制的具體影響作用有待進一步證實[22]。

黃褐斑皮損區(qū)可伴有不同程度的炎性反應(yīng)，黑色素細胞作為吞噬細胞可產(chǎn)生不同量黑色素應(yīng)對表皮炎性反應(yīng)[23]。同時可通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生炎性因子作用于角質(zhì)形成細胞。而炎性反應(yīng)可上調(diào)POMCmRNA、POMC 多肽和MSH 受體水平[24]，誘導(dǎo)黑色素細胞產(chǎn)生NO，刺激TYR 活性，促進黑色素合成[25]。微陣列分析證明在黃褐斑病變皮膚中PPAR 信號通路的基因下調(diào)[26]，激活PPAR 可競爭抑制炎性反應(yīng)信號通路和炎性介質(zhì)的生成，本研究中預(yù)測的PPAR 信號通路與研究相一致[27]。

在黑色素分布過程中，角質(zhì)形成細胞中的黑色素小體數(shù)量是導(dǎo)致皮膚色素沉著差異的主要原因。相關(guān)研究表明，精氨酸酶2（ARG2）可刺激細胞衰老、減少角質(zhì)形成細胞的自噬、減少黑色素體的轉(zhuǎn)移和降解從而導(dǎo)致皮膚色素沉著[28]。紫外線刺激可上調(diào)角質(zhì)形成細胞中磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路及一氧化氮/吸入一氧化氮（NO/iNO）信號通路產(chǎn)生NO，在旁分泌模式下刺激TYR 活性，促進黑色素合成[29]。雌激素（ESR）、孕激素（PROG）等卵巢激素也可刺激PI3K/Akt 和NF-κB 通路，導(dǎo)致誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達升高和NO 產(chǎn)生，刺激角質(zhì)形成細胞和黑色素細胞的增殖。同時，雌激素與黑色素細胞及角質(zhì)形成細胞上的受體結(jié)合可提高cAMP 水平并上調(diào)TYR、MITF，誘導(dǎo)黑色素生成[30]。研究表明，男性患者服用抗雄激素非那雄胺后由于雄激素受刺激一定程度上提高了黃褐斑患病率，進一步印證了性激素對黃褐斑發(fā)病機制的影響，同時提示黃褐斑發(fā)病率女性高于男性可能與卵巢激素刺激iNOS基因表達促進UV 誘導(dǎo)的致病過程相關(guān)[31]。本研究中預(yù)測的ARG2 及性激素相關(guān)靶點雄激素受體（AR）、雌激素受體1（ESR1）、ESR2、參與雌激素合成的酶（CYP1A1）、孕酮受體（PGR）及信號通路雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、類固醇激素合成（Steroid hormone biosynthesis）、卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis）與相關(guān)研究相一致[32]。

本研究通過對現(xiàn)代臨床研究中基于古方的黃褐斑外用方劑進行數(shù)據(jù)挖掘分析，獲取12 味核心藥物，了解其用藥規(guī)律及作用機制，為其外用治療黃褐斑的有效性提供了部分分子層面依據(jù)，為臨床黃褐斑中醫(yī)外治療法提供根據(jù)及思路。本研究尚存在不足之處，后續(xù)研究可將藥物的劑量與劑型因素納入分析，依據(jù)本研究進一步分析與優(yōu)化，進而制定黃褐斑中醫(yī)外治方劑并進行臨床驗證，以有效提高中醫(yī)外治黃褐斑臨床療效。