王 英，李云飛，陳庚超，朗帕實(shí)，袁梓程，高 燕，彭 云，吳思超*

（1.昆明海關(guān)技術(shù)中心,云南 昆明 650208；2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心,廣東 東莞 523071）

三七作為一種重要的藥用植物資源和保健食品[1]，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、止血活血等藥理作用[2-7]。由于三七在生長(zhǎng)過程中，極易遭受各種病蟲的侵害，因此在種植過程中難免會(huì)使用農(nóng)藥，藥農(nóng)過量使用農(nóng)藥防治三七的病蟲害，導(dǎo)致三七中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)[8-9]，不僅對(duì)人類健康造成威脅還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。由于農(nóng)藥殘留超標(biāo)導(dǎo)致我國(guó)出口中藥被封存、銷毀或者退貨的情形[10-11]時(shí)有發(fā)生，因此建立三七中農(nóng)藥多殘留的快速篩查方法十分必要。

三七在種植過程中使用的農(nóng)藥主要包括殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲菊醋和氨基甲酸酯等類型[8]。目前農(nóng)藥殘留前處理凈化方法主要包括凝膠滲透色譜法(GPC)[12]、固相萃取法(SPE)[13]以及QuEChERS 法[14]。檢測(cè)技術(shù)上主要采用氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高分辨質(zhì)譜法等[15-18]。隨著農(nóng)藥種類的不斷增加，亟須發(fā)展高通量、快速有效的同時(shí)篩查多類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法[19]，四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法具有選擇性高、靈敏度高、掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)，在沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下通過全掃描數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)定性確證[20]，適用于多種目標(biāo)化合物的篩查和確證分析[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜建立了三七中66 種農(nóng)藥殘留的快速篩查檢測(cè)方法，較普通液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的分辨率，該方法前處理簡(jiǎn)單、快捷、實(shí)用性強(qiáng)，可為保障三七安全性評(píng)估提供參考，同時(shí)也可為解決中藥中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)問題、保障中藥質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七藥材購于云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司；66 種農(nóng)藥液體混合對(duì)照品溶液（具體種類詳見表1）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，質(zhì)量濃度為50 mg/L；甲醇（色譜純）購自美國(guó)Sigma 公司；乙腈（色譜純）購自美國(guó)Sigma 公司；甲酸銨、冰乙酸（色譜純）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸（分析純）購自西隴科學(xué)股份有限公司；無水MgSO4和NaCl（分析純）、石墨化碳黑氨基復(fù)合SPE 小柱均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；300 mgPSA+300 mg C18+900 mg 無水MgSO4+90 mgGCB，購自山東青云實(shí)驗(yàn)耗材有限公司。

表1 66 種農(nóng)藥的分子式、保留時(shí)間、相對(duì)質(zhì)量偏差、母離子和碎片離子Tab.1 Molecular formulas,retention times,relative mass deviations,precursor ions and fragment ions of the 66 pesticide residues

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 Q-Exactive 超高效液相色譜－四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS，美國(guó)Thermo Fisher 公司）；高速冷凍離心機(jī)（3-30K，德國(guó)Sigma 公司）；渦旋振蕩器（HS501，德國(guó)IKA 公司）；分析天平（XPE105，德國(guó)Sigma 公司）；超純水系統(tǒng)（電導(dǎo)率為18.2 MΩ，美國(guó)Millipore公司）；氮吹儀（TurboVap LV，瑞典Biotage 公司）；旋渦混合儀(瑞士Mettler Toledo)；凝膠色譜儀（GPC Ultra 10836，德國(guó)LC Tech 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配置

精密量取上述66 種農(nóng)藥液體混合對(duì)照品溶液1 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配置為10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱避光保存；精密量取上述適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配置為各目標(biāo)化合物相應(yīng)質(zhì)量濃度（1.0 mg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

通過全掃描模式對(duì)1.0 mg/L 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，得到66 種農(nóng)藥的一級(jí)離子流圖，保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)等信息，同時(shí)采用ddMS2二級(jí)質(zhì)譜掃描模式，獲得目標(biāo)化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖和特征碎片離子[19]，利用Trace finder 軟件對(duì)每種農(nóng)藥的保留時(shí)間，母離子、子離子精確質(zhì)量數(shù)及二級(jí)特征碎片離子與各自目標(biāo)化合物名稱、化學(xué)式相關(guān)聯(lián)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建（見表1）。

根據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫對(duì)三七樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行定性篩查確證，依據(jù)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)偏差與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，若獲得2 個(gè)或2 個(gè)以上特征碎片離子匹配，質(zhì)量數(shù)的偏差小于或等于5.00×10-6，保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，可以判定試樣中含有該種農(nóng)藥。以各目標(biāo)化合物母離子作為定量離子，并采用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量[19]。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于66 種農(nóng)藥的理化性質(zhì)各異，本實(shí)驗(yàn)分別比較了Accucore aQ 色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)、Hypersil GOLD C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm）、ACQUITY BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果，發(fā)現(xiàn)Accucore aQ 色譜柱對(duì)66 種農(nóng)藥有較好的分離效果。同時(shí)，比較了水相中添加不同濃度的甲酸、乙酸、甲酸銨，有機(jī)相為甲醇、乙腈的不同流動(dòng)相的色譜分離效果，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）+甲醇組合能夠更好地分離目標(biāo)化合物并能提供良好的色譜峰型，同時(shí)具有較高的響應(yīng)強(qiáng)度，總離子色譜圖見圖1。

圖1 Accucore aQ 色譜柱總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Accucore aQ column

1.3.3.2 前處理方式的優(yōu)化

本研究分別考察了GPC、石墨化碳黑氨基復(fù)合SPE 小柱和經(jīng)典的QuEChERS 方法3 種前處理方法。以空白三七樣品10 μg/kg 為加標(biāo)濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其回收率結(jié)果如圖2 所示。由圖2可知，QuEChERS 方法有64 個(gè)化合物的加標(biāo)回收率集中在70%～120%，優(yōu)于其他兩種前處理方法，因此本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS 方法進(jìn)行前處理，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、高效、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)非常適合多類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)前處理。

圖2 66 種農(nóng)藥不同前處理回收率(10 μg/kg) (n=3)Fig.2 Recoveries of 66 kinds of pesticide residues under different pretreatments (10 μg/kg) (n=3)

1.3.4 三七樣品的測(cè)定

1.3.4.1 樣品前處理

采用QuECHERS 方法對(duì)三七樣品進(jìn)行前處理：精密稱定三七樣品粉末（過三號(hào)篩）3 g，加入1%冰乙酸溶液15 mL，渦旋放置30 min，精密加入乙腈15 mL，震蕩提取5 min，加入無水MgSO4和NaCl（4 g+1 g），渦旋混勻之后4 200 r/min 離心5 min，取上清液10 mL 加入凈化劑（300 mg PSA+300 mg C18+900 mg 無水MgSO4+90 mg GCB）渦旋混勻，震蕩提取5 min 后，4 200 r/min 離心5 min，通過0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜，待測(cè)定。

1.3.4.2 色譜條件

色譜柱：Accucore aQ 色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為水相由5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液組成；B為有機(jī)相由甲醇溶液組成；梯度洗脫方式，具體系統(tǒng)程序詳見表2。

表2 梯度洗脫表Tab.2 Gradient elution program

1.3.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子Full MS-ddMS2掃描模式；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；離子源溫度：325 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃；碰撞氣：Medium；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～1 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～800；一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率70 000，二級(jí)分辨率為17 500。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別以空白三七樣品經(jīng)上述前處理方法后獲得的基質(zhì)溶液和甲醇為溶劑，分別配置質(zhì)量濃度100 μg/L 的農(nóng)藥混標(biāo)溶液，測(cè)定各目標(biāo)化合物的峰面積響應(yīng)值。基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式[22]如下：

式中：A1為基質(zhì)溶液中目標(biāo)化合物響應(yīng)值；A2為甲醇溶劑中目標(biāo)化合物響應(yīng)值。

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)值大于100%時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)值小于100%時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，27 種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度基質(zhì)抑制效應(yīng)，為克服基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2.2 線性范圍與定量限

采用空白三七樣品經(jīng)上述前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，配置成質(zhì)量濃度分別為0、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以母離子作為定量離子，以各目標(biāo)化合物色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，66 種農(nóng)藥在0.005～0.5 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，R2均大于0.99。用基質(zhì)空白溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度確定為檢出限(limit of detection，LOD)[24]，得到各目標(biāo)化合物檢出限(LOD)在0.005～0.01 mg/kg 范圍內(nèi)，可滿足痕量分析檢測(cè)要求，即樣品中待測(cè)組分含量低于100 μg/g 的分析工作[25](見表3)。

表3 66 種農(nóng)藥線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 The linear equation,correlation coefficient and LODs of 66 pesticide residues

2.3 回收率與精密度

為驗(yàn)證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度，向空白三七樣品中分別添加質(zhì)量濃度分別為10、50、100 μg/L 的66 種農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照相同的前處理方法和儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，各水平重復(fù)6 次。以測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的精密度，并計(jì)算不同濃度的加標(biāo)回收率。由表4 可知，66 種農(nóng)藥平均回收率在71.7%～110.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.2%～6.8%之間，說明本方法回收率高，精密度高，可用于三七中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析。

表4 66 種農(nóng)藥加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Tab.4 The piked recoveries and relative standard deviations of 66 pesticide residues

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

通過檢測(cè)市售三七樣品，進(jìn)一步評(píng)估該方法在實(shí)際樣品檢測(cè)的實(shí)用性。將該方法應(yīng)用于50 個(gè)三七樣本進(jìn)行非靶向篩查分析，將獲得的三七樣品的色譜信息和質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索對(duì)比，確定所測(cè)三七樣品中含有農(nóng)藥烯酰嗎啉、惡霜靈、戊唑醇、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑。

利用基質(zhì)匹配外標(biāo)法，對(duì)待測(cè)三七樣品中的烯酰嗎啉、惡霜靈、戊唑醇、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行定量分析，得到待測(cè)三七樣品中烯酰嗎啉含量為0.058～2.45 mg/kg、惡霜靈含量為0.045～1.38 mg/kg、戊唑醇含量為0.44～2.30 mg/kg、甲基硫菌靈含量為0.072～0.86 mg/kg、苯醚甲環(huán)唑含量為0.065～5.40 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜，建立了三七中66 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，該方法快捷簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高、回收率好，可針對(duì)性地對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速篩查。在沒有對(duì)照品的情況下，可與所建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息等進(jìn)行匹配，可以實(shí)現(xiàn)非目標(biāo)化合物的定性篩查。該方法可為中藥農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)參考。