陳運財 王捷鵬 朱偉

(1.廣東醫(yī)科大學(xué),廣東 湛江 523808; 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬惠東縣人民醫(yī)院,廣東 惠州 516300)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計[1],結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中占第3位和第5位,且隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等的改變,其發(fā)病率逐年上升。根治性手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放化療是臨床治療結(jié)腸癌的有效手段,但結(jié)腸癌手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,患者遠(yuǎn)期生存率低[2]。既往調(diào)查顯示[3],結(jié)腸癌患者術(shù)后5年生存率僅有60%左右,故尋找能夠影響結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素,對提高患者的遠(yuǎn)期生存率具有重要意義。血小板凝血酶蛋白1(Thrombospondin-1,THBS1)是鈣結(jié)合糖蛋白,在腫瘤發(fā)生、血管生成及血小板凝集中均發(fā)揮作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)[5-6],THBS1可促進(jìn)癌組織的侵襲和遷移能力,在一定程度上影響患者預(yù)后。但目前關(guān)于THBS1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征和根治性手術(shù)后患者遠(yuǎn)期生存關(guān)系的相關(guān)研究較少?；诖?本研究通過免疫組化法檢測結(jié)腸癌組織中THBS1的表達(dá),探討THBS1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征及根治性手術(shù)后遠(yuǎn)期生存的關(guān)系,以期為臨床治療結(jié)腸癌補充理論依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月—2019年4月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬惠東縣人民醫(yī)院消化科收治的行根治手術(shù)治療的108例結(jié)腸癌患者作為研究對象,其中男64例,女44例;年齡38～73歲,平均(55.67±10.13)歲;腫瘤≤5 cm 69例,腫瘤>5 cm 39例;TNM分期[7]:Ⅰ期13例;Ⅱ期42例;Ⅲ期53例;癌組織低分化31例、中分化38例、高分化39例;腫瘤浸潤至黏膜及黏膜下層42例,浸潤至肌層及臟層腹膜66例;腫瘤位于左半結(jié)腸59例,位于右半結(jié)腸49例;潰瘍型腫瘤57例,隆起型腫瘤37例,浸潤型腫瘤14例。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)活檢確診為結(jié)腸癌[8]。②患者均為初診,無相關(guān)治療史。③均行根治性手術(shù)治療。④患者均知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有腸道感染性疾病。②合并有嚴(yán)重器官功能障礙。③腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤。④妊娠或哺乳期婦女。⑤免疫系統(tǒng)存在功能性障礙。⑥存在凝血功能障礙。⑦存在放、化療禁忌者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 采用免疫組化法檢測術(shù)中所取組織的THBS1表達(dá) 用10%濃度的中性甲醛緩沖液固定手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織,固定24 h行石蠟包埋后做連續(xù)切片,厚度4 μm;將石蠟切片于60 ℃烤箱中烘烤3～5 h后脫蠟,行梯度乙醇水化后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次,5 min/次;將切片置于PH 6.0檸檬酸鈉工作液中,并于100 ℃下加熱25 min,室溫下自然冷卻;將切片于3%的過氧化氫溶液中浸泡10 min后沖洗;滴加一抗、二抗工作液,再滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液,室溫下孵育后用蘇木素復(fù)染1 min,脫水并行透明處理后封片,鏡下觀察實驗結(jié)果并拍照。每張切片根據(jù)陽性表達(dá)及染色強度綜合評分,染色強度評分:細(xì)胞無染色為0分,弱染色為1分,中等強度染色為2分,強染色為3分;陽性表達(dá)評分:無陽性表達(dá)為0分,陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤25%為1分,25%<陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤50%為2分,陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)>50%為3分,最終得分=染色強度得分×陽性表達(dá)得分,將最終得分≥3分者定為THBS1陽性表達(dá)。

1.2.2 術(shù)后輔助化療 對腫瘤侵犯臟層腹膜、侵犯或粘連臨近器官及結(jié)構(gòu)、標(biāo)本檢出淋巴結(jié)不足(少于12枚)、血管淋巴管浸潤、神經(jīng)侵犯、術(shù)前腸梗阻或穿孔的Ⅱ期及所有Ⅲ期結(jié)腸癌患者于術(shù)后1個月左右開始輔助化療,根據(jù)患者自身情況化療3～6個月。

1.2.3 術(shù)后隨訪 術(shù)后通過電話及門診隨訪3年,每3個月復(fù)查1次胸片、腹部超聲并行血常規(guī)、大便潛血、腫瘤標(biāo)志物等實驗室檢查,每年復(fù)查1次腹盆部CT和結(jié)腸鏡觀察是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,將患者因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移造成的死亡作為隨訪終止事件,將隨訪期內(nèi)存活及因其他事件死亡的患者數(shù)據(jù)記為截尾數(shù)據(jù),記錄并分析3年內(nèi)患者的生存情況。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中THBS1表達(dá)。②對比不同臨床病理特征患者的結(jié)腸癌組織THBS1表達(dá)。③結(jié)腸癌患者術(shù)后3年的生存情況及結(jié)腸癌組織THBS1不同表達(dá)患者生存情況比較。④分析結(jié)腸癌組織中THBS1表達(dá)與結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中THBS1表達(dá)比較 結(jié)腸癌組織中THBS1的陽性表達(dá)率為62.04%(67/108),癌旁正常組織中THBS1的陽性表達(dá)率為19.44%(21/108),THBS1在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(2=40.577,P<0.05)。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中THBS1表達(dá)(400×)

2.2 不同臨床病理特征患者的結(jié)腸癌組織THBS1表達(dá)對比 不同年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、腫瘤大小的結(jié)腸癌患者的癌組織THBS1陽性表達(dá)率無明顯差異(P>0.05),TNM分期Ⅲ期、低分化、腫瘤浸潤至肌層及臟層腹膜的結(jié)腸癌患者的癌組織THBS1陽性表達(dá)率均高于TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、中/高分化、腫瘤浸潤至黏膜及黏膜下層的結(jié)腸癌患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的結(jié)腸癌組織THBS1表達(dá)比較[n(×10-2) ]

2.3 結(jié)腸癌術(shù)后3年的生存情況及結(jié)腸癌組織THBS1不同表達(dá)患者生存情況比較 108例結(jié)腸癌根治術(shù)后3年隨訪期間無失訪患者,共有22例因腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移死亡,3年生存率為79.63%(86/108)。其中67例結(jié)腸癌組織THBS1陽性表達(dá)患者中19例死亡,41例結(jié)腸癌組織THBS1陰性表達(dá)患者中3例死亡,經(jīng)Log-rank檢驗,結(jié)腸癌THBS1陽性表達(dá)患者3年生存率低于陰性表達(dá)患者(2=6.941,P=0.008)。見圖2。

圖2 結(jié)腸癌組織 THBS1陽性和陰性表達(dá)患者的遠(yuǎn)期生存情況比較

2.4 結(jié)腸癌組織中THBS1表達(dá)與結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的關(guān)系 死亡組與生存組的性別、腫瘤位置、大體類型、腫瘤大小、手術(shù)方式對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),死亡組中年齡>60歲、TNM分期Ⅲ期、低分化、腫瘤浸潤至肌層及臟層腹膜和結(jié)腸癌組織THBS1陽性表達(dá)占比均高于生存組(P<0.05)(表2)。將上述死亡組和生存組臨床資料比較中P<0.05的項目作為自變量、結(jié)腸癌患者術(shù)后3年內(nèi)生存情況設(shè)為因變量進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示年齡>60歲、TNM分期Ⅲ期、低分化、腫瘤浸潤至肌層及臟層腹膜以及結(jié)腸癌組織THBS1陽性表達(dá)均是結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的危險因素(P<0.05)。見表3。

表2 死亡組與生存組臨床資料比較[n(×10-2) ]

表3 結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的Cox回歸分析

3 討論

結(jié)腸癌的具體病因尚不明確,現(xiàn)階段多數(shù)結(jié)腸癌為腺瘤癌變所致,且與慢性結(jié)腸炎、結(jié)腸性吸血蟲病、遺傳易感性有關(guān)[9]。近年來,結(jié)腸癌在治療上已取得顯著進(jìn)步,臨床對于未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者行根治性手術(shù)治療及術(shù)后輔助化療,可有效延長患者的生存時間,但結(jié)腸癌患者的遠(yuǎn)期生存率整體仍處于較低水平且個體差異大[10]。本研究隨訪結(jié)果顯示,結(jié)腸癌患者3年內(nèi)生存率為79.63%,與陸歡等[11]報道的77.78%相近,提示結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存率低,證實探討其影響因素十分必要。

THBS1是由白細(xì)胞、血小板及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的一種多功能鈣合糖蛋白,可在多個人體器官中表達(dá),能調(diào)控機體內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)等[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)[14],THBS1可以作為TGF-β的生理激活因子,調(diào)控TGF-β參與腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程并同時促進(jìn)VEGF的增加,進(jìn)而加快了癌癥的進(jìn)展。此次研究中,THBS1在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織,且THBS1表達(dá)與結(jié)腸癌的TNM分期、組織分化程度、浸潤深度有關(guān),提示THBS1參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。與石慧等[15]報道相符。Her等[16]研究發(fā)現(xiàn),CB-5083可在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)蛋白毒性且對抗結(jié)腸癌細(xì)胞p97有抑制作用,而THBS1能上調(diào)機體內(nèi)的CB-5083促進(jìn)結(jié)腸組織的癌變和癌組織的增殖;殷茜等[17]通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)THBS1表達(dá)與結(jié)腸癌惡性程度相關(guān),上調(diào)THBS1表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;另有研究報道[18-19],THBS1能通過吸附miR-125-5p、調(diào)節(jié)波形蛋白、N-鈣粘蛋白、SOX4等表達(dá)來促進(jìn)癌組織的增殖和轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,上述報道從不同方向研究了THBS1對癌癥的作用機制,均說明THBS1對結(jié)腸癌的病情進(jìn)展起促進(jìn)作用,本研究結(jié)果與上述相關(guān)報道及分析相符。此外,本研究繪制Kaplan-Meier曲線分析結(jié)腸癌組織THBS1不同表達(dá)患者生存情況,發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中THBS1陽性表達(dá)患者3年內(nèi)死亡率高于陰性表達(dá)患者,且經(jīng)進(jìn)一步Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)THBS1陽性表達(dá)是結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的危險因素。THBS1的高表達(dá)能促進(jìn)正常組織癌變及癌組織的增殖、轉(zhuǎn)移并抑制癌組織的凋亡,是造成多種癌癥患者預(yù)后不良的危險因素[20]。既往研究顯示[21],通過上調(diào)癌細(xì)胞中THBS1的表達(dá),能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡,使得行手術(shù)治療后的癌癥患者易復(fù)發(fā)和死亡;Bonnet-Magnaval等[22]通過降解THBS1 mRNA使得肺癌患者癌組織中的THBS1陽性表達(dá)減少,從而延長了肺癌患者的無復(fù)發(fā)生存期,以上研究均提示了結(jié)腸癌組織THBS1陽性表達(dá)影響結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存。

此外,本研究在分析結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素時發(fā)現(xiàn),年齡、組織分化程度、TNM分期、浸潤深度均是結(jié)腸癌患者遠(yuǎn)期生存的影響因素。其中年齡是所有進(jìn)展性疾病預(yù)后的基線因素,隨著年齡的上升,患者體內(nèi)器官的生理功能下降,自我修復(fù)能力降低,后續(xù)治療效果及預(yù)后較差,既往有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者年齡與部分自噬基因表達(dá)水平具有相關(guān)性,是評估預(yù)后的常規(guī)因素[23]。大量研究證實,分化程度和TNM分期是臨床評價腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[24-25],腫瘤分化越低,其侵襲及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力越強,導(dǎo)致預(yù)后越差,而TNM分期越晚,提示腫瘤浸潤程度越深,且往往存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,術(shù)后復(fù)發(fā)及發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的可能性更高。

4 結(jié)論

結(jié)腸癌患者癌組織THBS1陽性表達(dá)率高,不同TNM分期、組織分化程度、浸潤深度患者的癌組織THBS1陽性表達(dá)率差異顯著,且影響行根治性手術(shù)治療后結(jié)腸癌患者的遠(yuǎn)期生存。結(jié)腸癌組織THBS1表達(dá)可為指導(dǎo)臨床及時干預(yù)治療結(jié)腸癌患者提供參考與新思路,改善結(jié)腸癌患者預(yù)后。