耿永芝 李國偉 劉曉豆 韓磊 孫建利 檀立端

(承德市中心醫(yī)院急診科,河北 承德 067000)

橫紋肌溶解癥是一種嚴(yán)重的綜合征,由骨骼肌損傷后受損肌肉細(xì)胞釋放到體循環(huán)中的分解產(chǎn)物引起各種病理狀況,如擠壓傷、感染、肌病和肌肉萎縮癥、毒素和某些藥物都會導(dǎo)致橫紋肌溶解[1-2]。急性腎損傷是橫紋肌溶解癥的主要并發(fā)癥之一,大約10%～50%的橫紋肌溶解癥患者會出現(xiàn)急性腎損傷[3]。線粒體自噬對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和確保健康的線粒體十分重要,PTEN誘導(dǎo)激酶1/帕金森病相關(guān)基因(PINK1/parkin)途徑是線粒體自噬的主要調(diào)節(jié)劑,已在多種疾病模型中進(jìn)行了研究[4]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)/PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬緩解腎纖維化和腎損傷?；诖?研究橫紋肌溶解導(dǎo)致的急性腎損傷中線粒體自噬,對該疾病的治療有重要意義。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類化合物,具有多種生理功能。最近也有報(bào)道葛根素可治療腎損傷相關(guān)疾病[6-7]。另有研究表明葛根素可通過增加自噬通量,LC3-II和p62表達(dá)激活自噬緩解鉛誘導(dǎo)的腎臟損傷[8]。但葛根素是否可緩解橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷以及是否可通過線粒體自噬發(fā)揮作用鮮有報(bào)道。本研究通過建立橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型,旨在研究葛根素對橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只SPF級成年雄性SD大鼠,體重180～220 g,購自中國科學(xué)院動物研究所[許可證號:SYXK(京)2021-0063]。將大鼠飼養(yǎng)在溫度21～25 ℃、濕度45%～55%以及12 h光/暗循環(huán)的動物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。大鼠自由飲水,定時(shí)喂食。本研究已獲得本院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:2021-0375)。

1.2 主要試劑與儀器 葛根素(K901177)購自上海雅吉生物科技有限公司;3-MA(HY-19312)購自MCE公司;活性氧(ROS)(E004-1-1)、谷胱甘肽(GSH)(A006-1-1)、丙二醛(MDA)(A003-2-2)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001-3-2)和過氧化氫酶(CAT)(A007-1-1)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(E-EL-R2856c)、大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒(E-EL-R0012c)、大鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(E-EL-R0015c)購自伊萊瑞特公司;抗體LC3 I/II(ab128025)、PINK1(ab216144)、parkin(ab77924)、GAPDH(ab8245)購自abcam公司。DW-86L416G-80 ℃冰箱購自海爾集團(tuán)公司;JEM-2100透射電鏡購自日本電子株式會社;SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司;SP8共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司;GBA-1000自動生化分析儀購自深圳市國賽生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組給藥 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將大鼠分為正常組、模型組[9](50%甘油10 mL/kg)、葛根素低劑量組[7](葛根素50 mg/kg)、葛根素中劑量組(葛根素100 mg/kg)、葛根素高劑量組(葛根素200 mg/kg)、3-MA組[10](腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每組10只。正常組和模型組動物灌胃相應(yīng)劑量生理鹽水,各給藥組灌胃相應(yīng)劑量葛根素,3-MA組在給藥前1 h腹腔注射相應(yīng)劑量3-MA,其余組腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水,連續(xù)給藥7 d。第7天所有大鼠禁水禁食24 h后,除正常組外其余各組大鼠在雙側(cè)后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,正常組注射相應(yīng)劑量生理鹽水,處理后將所有大鼠放入代謝籠中,恢復(fù)飲食飲水,收集大鼠24 h尿液。注射甘油24 h后,所有大鼠使用100 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,并取出大鼠腎臟組織。所有大鼠左腎組織保存在-80 ℃冰箱中進(jìn)一步分析,隨機(jī)取各組5只大鼠右腎組織固定在4%多聚甲醛中,另5只大鼠右腎固定在2.5%戊二醛進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.3.2 血清生化分析 各組大鼠動脈血在4 ℃冰箱中靜置2 h后,以3 500 r/min,4 ℃下離心10 min,收集血清并儲存在-80 ℃進(jìn)一步分析。自動生化分析儀測量各組大鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶 (CK)水平。

1.3.3 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 使用ELISA試劑盒,根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.4 HE染色觀察腎組織病理 取各組5只保存在4%多聚甲醛中的大鼠腎臟組織,不同梯度乙醇脫水,然后在二甲苯中浸泡,最后使用石蠟包埋。用切片機(jī)取4 μm厚的切片使用HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。組織學(xué)切片根據(jù)腎小管間質(zhì)損傷、空泡化、刷狀邊緣消失、小管擴(kuò)張和壞死進(jìn)行評估(0分:無損傷;1分:0<損傷≤10%;2分:10%<損傷≤25%;3分:25%<損傷≤45%;4分:45%<損傷≤75%;5分:損傷>75%)。

1.3.5 試劑盒法測量大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA水平 取各組5只大鼠冰凍腎臟組織制備10%勻漿,并在4 ℃下3 000 r/min離心15 min,得到上清液。使用相應(yīng)試劑盒檢測腎臟組織中GSH、MDA、SOD的水平,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 化學(xué)熒光法檢測大鼠腎臟組織ROS水平 取1.3.5實(shí)驗(yàn)方法剩余各組大鼠腎臟組織勻漿液,離心后得上清液,加入DCFH-DA工作液混勻,37 ℃孵育30 min,使用熒光酶標(biāo)儀檢測在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm下檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.7 透射電子顯微鏡觀察 將固定在2.5%戊二醛中2 h的5只大鼠腎臟組織經(jīng)漂洗后再使用1%鋨酸固定2 h,漂洗后乙醇脫水、經(jīng)丙酮浸透后37 ℃包埋在環(huán)氧樹脂中12 h切成薄片,5%乙酸鈾和檸檬酸鉛染色,透射電鏡觀察攝片。

1.3.8 免疫熒光法檢測腎臟組織LC3和線粒體的共定位 石蠟包埋的剩余大鼠腎臟組織,經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后加入一抗LC3和COX4在4 ℃孵育過夜,并與各自二抗37 ℃孵育1 h后,使用康淬滅封片劑封片,最后使用共聚焦顯微鏡觀察拍照,Image軟件進(jìn)行分析。

1.3.9 Western Blot檢測 各組剩余5只大鼠冰凍的腎臟組織,使用RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。使用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,將膜與LC3 II/ I、PINK1、parkin、GAPDH抗體在 4 ℃孵育過夜后與HRP偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。最后,將膜與增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑一起孵育顯色,并使用Image J軟件量化蛋白灰度值。GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對大鼠血清SCr、BUN、CK的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠血清SCr、BUN、CK水平顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 葛根素對大鼠血清SCr、BUN、CK的影響

2.2 葛根素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 葛根素對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

2.3 葛根素對大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響 病理學(xué)顯示對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整,模型組大鼠腎臟組織可見明顯腎小球、腎小管擴(kuò)張,出現(xiàn)空泡化、間質(zhì)水腫以及炎性細(xì)胞浸潤,葛根素低、中、高劑量組減輕大鼠腎臟組織病理學(xué)損傷;但是較葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟組織損傷進(jìn)一步加重。病理學(xué)損傷評分結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠腎臟病理學(xué)損傷評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟病理學(xué)損傷評分顯著降低(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟病理學(xué)損傷評分顯著升高(P<0.05),見圖1、表3。

圖1 葛根組對大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響(400×)

表3 葛根素對大鼠腎臟病理學(xué)損傷評分的影響

2.4 葛根素對大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA、ROS水平的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著降低,SOD、GSH水平升高(P<0.05);與葛根素高劑量組相比,3-MA組大鼠腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低(P<0.05),見圖2、表4。

圖2 葛根素對大鼠腎臟組織ROS水平的影響(200×)

表4 葛根素對大鼠腎臟組織SOD、GSH、MDA、ROS水平的影響

2.5 葛根素對大鼠腎臟組織線粒體和自噬小體的影響 正常組大鼠細(xì)胞線粒體表現(xiàn)出正常的形態(tài),有清晰可辨的嵴;與正常組相比,模型組大鼠可觀察到明顯的線粒體腫脹,線粒體脊紊亂、斷裂或消失,伴有明顯的空泡變性,并有自噬小體形成,然而葛根素低、中、高劑量組大鼠線粒體損傷明顯減輕,自噬小體數(shù)量顯著增加;與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠線粒體損傷加重,自噬小體很少,見圖3。

圖3 葛根素對大鼠腎臟組織線粒體和自噬小體的影響(10000×)

2.6 葛根素對大鼠腎臟組織LC3和線粒體共定位的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟組織可見LC3標(biāo)記的自噬小體與COX4標(biāo)記的線粒體共定位信號;與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織LC3標(biāo)記的自噬小體與COX4標(biāo)記的線粒體共定位信號明顯增多;與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠LC3標(biāo)記的自噬小體與COX4標(biāo)記的線粒體共定位信號明顯降低,見圖4。

圖4 葛根素對大鼠腎臟組織LC3和線粒體共定位的影響(200×)

2.7 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin表達(dá)的影響 與正常組相比,模型組大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,葛根素低、中、高劑量組大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05);與葛根素高劑量組大鼠相比,3-MA組大鼠腎臟組織LC3 II/LC3 I、PINK1、parkin蛋白表達(dá)降低(P<0.05),見圖5、表5。

圖5 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/I、PINK1、parkin表達(dá)的影響

表5 葛根素對大鼠腎臟組織LC3 II/ I、PINK1、parkin表達(dá)的影響

3 討論

橫紋肌溶解癥是一種以骨骼肌分解和肌肉細(xì)胞內(nèi)容物如電解質(zhì)、肌紅蛋白和其他肌質(zhì)蛋白滲漏進(jìn)入體循環(huán)的綜合征,急性腎損傷是橫紋肌溶解癥的常見嚴(yán)重并發(fā)癥,如果發(fā)生急性腎損傷,預(yù)后會大大惡化,死亡率升高[11-12]。另外,肌紅蛋白游離對腎小管有毒,引起腎小管壞死和梗阻,導(dǎo)致腎血管收縮、腎結(jié)構(gòu)損傷以及氧化應(yīng)激,這些現(xiàn)象均是橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷特征[13]。在本研究中,通過向大鼠肌肉注射甘油誘發(fā)了急性腎損傷。肌肉注射甘油會造成廣泛的骨骼肌損傷,并使肌紅蛋白釋放到血液循環(huán)中,誘導(dǎo)橫紋肌溶解癥進(jìn)而導(dǎo)致氧化因子、炎癥以及腎血管收縮發(fā)生引起急性腎損傷[3]。葛根素是從葛根中提取的異黃酮類化合物,近期研究發(fā)現(xiàn)葛根素可用于治療腎損傷疾病,作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和凋亡以及抗炎等生理過程[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)大鼠雙側(cè)后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg后,大鼠血清SCr、BUN、CK、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,腎臟組織可見明顯腎小球、腎小管擴(kuò)張,出現(xiàn)空泡化、間質(zhì)水腫以及炎性細(xì)胞浸潤,腎臟MDA、ROS水平顯著升高,SOD、GSH水平降低,通過葛根素灌胃給藥后,明顯抑制橫紋肌溶解對大鼠的腎損傷以及抑制炎癥因子和氧化應(yīng)激的發(fā)生。

線粒體自噬作為一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞過程,通過清除功能失調(diào)的線粒體以及防止ROS過度積累,在維持線粒體自身穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用[16-17]。線粒體自噬在急性腎損傷期間線粒體質(zhì)量控制,腎小管細(xì)胞存活和腎功能中起著關(guān)鍵作用[18]。PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前哺乳動物細(xì)胞中最成熟的線粒體自噬形式[19]。PINK1是一種重要的線粒體自噬調(diào)節(jié)劑,當(dāng)在靜止?fàn)顟B(tài)下時(shí),PINK1被結(jié)構(gòu)化地輸入到線粒體中,并被迅速裂解和降解,當(dāng)線粒體受損時(shí),PINK1導(dǎo)入后的降解被破壞,使得PINK1在線粒體外膜上聚集并進(jìn)一步募集Parkin,Parkin將線粒體泛素化,并將與泛素化結(jié)合的自噬受體招募到線粒體上,最后,通過與LC3直接相互作用招募自噬體,進(jìn)一步通過線粒體自噬機(jī)制降解受損線粒體[20-21]。研究表明,在急性腎損傷病理?xiàng)l件下,腎小管可能會激活線粒體自噬的多種途徑,其中PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是腎臟保護(hù)的主要途徑[22]。Lin等[23]研究發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在對比劑誘導(dǎo)的小鼠腎損傷中發(fā)揮重要作用,當(dāng)沉默PINK1表達(dá)時(shí),對比劑誘導(dǎo)的線粒體自噬會被逆轉(zhuǎn)進(jìn)而加重小鼠腎損傷,表明PINK1/Parkin信號通路發(fā)揮腎損傷保護(hù)作用。另外,張馳昊等[24]也研究發(fā)現(xiàn)蝦青素可通過激活PINK1/Parkin通路增強(qiáng)線粒體自噬,減少ROS釋放,從而減輕對比劑誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷。本研究結(jié)果顯示在橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠模型中,大鼠腎臟組織中可見LC3標(biāo)記的自噬小體與COX4標(biāo)記的線粒體共定位信號,并且腎臟組織中LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達(dá)升高,提示PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬在橫紋肌誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠中激活,但由于激活的自噬水平不足以發(fā)揮出明顯的腎損傷保護(hù)作用,因此大鼠腎損傷沒有得到緩解。通過使用葛根素干預(yù)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素可減輕橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠線粒體腫脹、線粒體脊紊亂、空泡性,并明顯增加腎臟組織LC3標(biāo)記的自噬小體與COX4標(biāo)記的線粒體共定位信號以及LC3 II/I、PINK1、parkin蛋白表達(dá),提示葛根素可通過進(jìn)一步激活PINK1/Parkin通路增強(qiáng)橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,從而減輕大鼠腎損傷。使用自噬抑制劑3-MA結(jié)果發(fā)現(xiàn),3-MA可明顯升高橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠血清SCr、BUN、CK、炎癥因子水平以及腎組織氧化應(yīng)激水平,加重大鼠腎損傷和線粒體損傷,并減弱大鼠線粒體自噬以及PINK1和Parkin蛋白表達(dá),進(jìn)一步證明了葛根素可通過PINK1/Parkin通路增強(qiáng)橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,進(jìn)而減輕大鼠腎損傷。本研究后續(xù)也將進(jìn)一步明確葛根素最佳給藥劑量并深入研究PINK1/Parkin通路參與葛根素保護(hù)腎臟的具體機(jī)制,為葛根素的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

葛根素可通過PINK1/Parkin通路增強(qiáng)橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠線粒體自噬,進(jìn)而減輕大鼠腎損傷,為臨床防治橫紋肌溶解誘導(dǎo)的急性腎損傷提供新思路。