耿紅玲 顧春曉 徐 珉 陳 頤

(廣東省中醫(yī)院婦科,廣州,510120)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一種常見的婦科生殖內分泌異常疾病,其發(fā)病機制復雜,但確切病因病理尚不明確。針對PCOS動物的造模多種多樣,我們檢索了相關文獻,將文獻中對PCOS造模選用的動物品系、造模藥物、時長,模型評價等方面進行分析,以期對PCOS造模有所幫助。

1 資料與方法

1.1 文獻來源 中國知識基礎設施數(shù)據(jù)庫(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、中國學術期刊數(shù)據(jù)庫(China Science Periodical Database,CSPD)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(Chinese Citation Database,CCD)。

1.2 檢索策略 檢索2017年1月1日至2021年3月10日CNKI、CSPD、CCD數(shù)據(jù)庫關于PCOS模型的相關文獻。發(fā)現(xiàn)國內暫未采用猴、豬、兔、羊動物構建PCOS模型,1篇采用斑馬魚構建PCOS模型[1],更多采用的是嚙齒類動物。CNKI、CSPD采用題目或關鍵詞:多囊卵巢綜合征或PCOS合并摘要鼠。CCD采用題目/關鍵詞:多囊卵巢綜合征或PCOS合并任意字段鼠。

1.3 納入標準 PCOS基礎研究,并且文中具體提到PCOS模型構建的方法。

1.4 排除標準 臨床類、綜述類、會議論文、比較不同動物模型的文獻。

1.5 數(shù)據(jù)的規(guī)范與數(shù)據(jù)庫的建立

1.5.1 數(shù)據(jù)的規(guī)范 由2位研究者檢索文獻并核實最終獲取文獻,對來源同一課題組或同一作者(但研究方法一樣)的不同文獻視為一篇。2位研究者錄入數(shù)據(jù)并保證真實準確。

1.5.2 數(shù)據(jù)庫的建立 建立Excel表格,分為品系、周齡,造模藥物,時長,高脂飲食,造模評價條目,分析文獻后逐條填入。

1.6 數(shù)據(jù)分析 共獲取文獻中選用的動物品系、鼠齡、造模藥物、造模時長、有無高脂飲食,造模評價等條目進行分析。

2 結果

2.1 動物品系和鼠齡選擇 品系:以大鼠使用最多,占比91.0%,小鼠占比9%。鼠齡:大鼠鼠齡多選用21～24日齡,占比44.2%,其次是大于24日齡小于60日齡,占比38.9%。在小鼠的文獻研究中,鼠齡選用最多的是21～30 d,占比82.3%。見表1。

表1 品系分布及鼠齡文獻數(shù)量

2.2 造模的方法

2.2.1 藥物選擇 目前文獻中嚙齒類PCOS動物模型通常采用雄激素、芳香酶抑制劑、人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,hCG)+胰島素、雌激素、抗孕激素以及改變光照等手段構建PCOS模型,其中造模方法采用最多的是雄激素造模,占比55.6%,其次是來曲唑造模,占比33.3%。見表2。

表2 造模藥物

2.2.2 造模時長 各種造模方法中造模時長最多的20～30 d,占比79.4%。見表3。

表3 造模時長

2.3 是否添加高脂高糖飲食 文獻中26.5%造模過程中聯(lián)合高脂高糖飼料喂食。

2.4 模型評價 文獻中造模后未對模型是否成功進行評價的占比31.2%,對模型進行評價的占比68.8%。所采用的模型評價方法中:單純選用陰道涂片方法的占比31.7%,其次是陰道涂片聯(lián)合血清學的方法,占比12.2%。見表4。

表4 模型評價

2.5 中醫(yī)證型的選擇 文獻中專門針對中醫(yī)證型建立PCOS模型,分別為腎陰虛[2]、腎陽虛[3]及痰濕型[4]。

3 討論

3.1 動物選擇 大鼠因對性激素敏感,有較穩(wěn)定的動情周期,而且對于實驗研究又經濟方便,因此是研究PCOS的首選動物。大鼠8周齡時性成熟,哺乳期為21 d。小鼠35～50日齡性成熟,哺乳期21 d。文獻中最多選用的是剛脫離哺乳期的鼠,其次是選用哺乳期后至性成熟期前的鼠,根據(jù)大鼠年齡與相當于人的年齡的換算,1～8周齡的大鼠相當于人的年齡的8歲,表明絕大多數(shù)文獻選用的動物在青春前期或青春期,并非處于性成熟期的育齡期。根據(jù)“青春期發(fā)育亢進學說”,假性性早熟已被確定為兒童日后發(fā)展成PCOS的危險因素之一,故剛離乳幼年雌性大鼠最為常用[5]。未斷乳的鼠在飼養(yǎng)及造模過程中容易死亡,故采用較少。1篇選用20周動物造模與其研究氧化損傷及組織退行性變化的亞急性衰老有關[6]。對年幼階段動物的研究是否也適用育齡女性的PCOS的認識,不同年齡段的PCOS動物模型是否存在差異,對于從來沒有規(guī)律的性周期與既往有過規(guī)律的性周期的動物造模,有無區(qū)別,值得進一步實驗驗證。

3.2 造模方法 采用最多的是雄激素及來曲唑構建模型。雄激素造模原理:脫氫表雄酮硫酸酯的原料藥不溶于水,硫酸普拉睪酮鈉是脫氫表雄酮硫酸酯的硫酸鈉鹽制劑。因脫氫表雄酮硫酸酯為油劑,不易吸收,在造模時可采用溶液酒精燈加熱溶解均勻后,并輕輕揉按注射部位促進吸收[7]。注射脫氫表雄酮硫酸酯是外源性途徑提高脫氫表雄酮硫酸酯水平,造成雄烯二酮水平增高,進而睪酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血癥。升高的雌酮水平對促卵泡素負反饋使促卵泡素相對不足,從而導致卵泡發(fā)育障礙及卵巢多囊改變。長期暴露于DHT、丙酸睪酮可導致大鼠排卵功能障礙。但是人PCOS與通過外源注射雄激素所建立起來的動物模型在對治療的反應、形態(tài)及激素改變等許多方面都有很大差別,故停用脫氫表雄酮硫酸酯后恢復排卵的周期仍有待進-步商榷[8]。

來曲唑造模原理:來曲唑為芳香酶抑制劑,通過抑制雄激素向雌激素轉化的限速酶——芳香化酶的活性,導致體內雄激素的增加,形成高雄激素血癥,進而發(fā)展為多囊卵巢。來曲唑誘導動物模型表現(xiàn)為PCOS生殖和代謝兩方面癥狀,但停止來曲唑誘導后,小鼠生殖功能恢復。同時,該模型不適合研究雌激素高的多囊卵巢綜合征[9]。

hCG+胰島素法造模原理:胰島素能刺激卵巢卵泡膜細胞和間質細胞合成雄激素,降低血中性激素結合蛋白,使雄激素濃度增加。hCG發(fā)揮類促黃體素的作用,在卵泡早期使用,可導致卵泡閉鎖。該模型卵巢呈多囊化、無排卵,大鼠體內持續(xù)促黃體素樣作用,出現(xiàn)高胰島素血癥和高雄激素血癥。雖然該模型的研究數(shù)量不如雄激素模型那么多,但該模型呈典型PCOS特征與臨床癥狀高度相似[9],并認為胰島素(Insulin,INS)+hCG法誘導的大鼠模型其生殖及代謝指標的變化較來曲唑更具優(yōu)勢[10]。

孕激素+hCG法原理:皮下埋避孕棒,可抑制下丘腦-垂體-卵巢(Hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)軸,使性激素分泌呈低水平,導致不排卵。此種造模方法時間較短。1篇左炔諾孕酮硅膠棒聯(lián)合hCG,造模時間10 d[11]。1篇皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(75 mg),3 d后2次皮下注射1.5 IU/0.2 mL hCG,共注射9 d[12]。此種模型卵巢與PCOS患者病理形態(tài)學和血漿激素水平相似。但該模型對HPO軸相關的PCOS的病因分析具有局限性[9]。

米非司酮造模原理:抗孕激素米非司酮作為一種強效的抗孕激素藥物,具有較強的抑制排卵作用。使用抗孕激素米非司酮造模后卵巢持續(xù)不排卵與血清促黃體素升高的同時作用促進卵巢多囊樣改變的形成;同時高水平的促黃體素能夠促進抑制素水平的升高,從而導致促卵泡素下降,促黃體素高表達能促進雄激素的合成,表現(xiàn)為睪酮水平明顯升高,促使卵泡閉鎖,具有PCOS的不排卵,雄激素增高的典型特征[13]。該種方法造模時間不長,文獻[14-15]分別為9 d、14 d。

雌激素造模原理:長期雌激素刺激可致下丘腦神經元退化,垂體出現(xiàn)代償性增生,并對促性腺激素釋放激素刺激出現(xiàn)異常反應,導致促黃體素顯著升高,同時促卵泡素也會升高。雖然戊酸雌二醇誘導嚙齒動物PCOS模型中卵巢的生理學和解剖學與人類相似,但未見人類典型代謝異常數(shù)據(jù),該模型不適合下丘腦-卵巢軸相關研究。此外,雌激素模型的性激素特征和卵巢形態(tài)特征也不一致[9]。

光照造模原理:嚙齒動物發(fā)情周期與晝夜系統(tǒng)相關,光暗周期可以控制動物促性腺激素和排卵情況。持續(xù)光照在無激素條件下可誘導PCOS模型,但該模型轉至正常光照周期環(huán)境,PCOS特征可恢復正常[9]。因此,需要進一步評估該模型在PCOS病因和發(fā)病機制與PCOS患者的相似性。

其他還有單純高糖高脂飲食構建PCOS模型,該造模方法并非由外源激素誘導或通過改變類固醇生成途徑誘導,高脂高糖飲食可導致大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥,胰島素水平升高可導致卵巢卵泡膜細胞的雄激素產生增加。雄激素水平升高與無排卵有關,并加速大鼠卵泡閉鎖,從而導致生殖健康受損及代謝紊亂[16]。亦提示高脂高糖飲食為PCOS潛在病因,但此種造模時間較長,造模時間為14周以上。

針對造模時長張萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮硫酸酯誘導20 d的PCOS大鼠模型,經歷4周后,不存在自愈,與持續(xù)造模相比更為簡便易行,同時其卵巢形態(tài)結構以及激素水平變化也更符合臨床表現(xiàn),但此模型因其藥物未被完全吸收,如研究激素水平,需要預留一定時間使其吸收。另一項模型研究表明來曲唑聯(lián)合高脂膳食連續(xù)喂養(yǎng)27 d,可成功復制符合PCOS胰島素抵抗患者病理特征及內分泌、代謝紊亂的大鼠模型[18]。對于多長時間可以造模成功,可能與造模藥物種類及方法有關。

雖然PCOS造模方法多種,但沒有哪一種可以比較全面反映PCOS的特征,也體現(xiàn)出PCOS疾病的復雜性及高度的異質性,需要不斷探索,尋找更貼近PCOS本質的造模方法。

3.3 是否添加高脂高糖飲食 26.5%的文獻提到造模過程中聯(lián)合高脂高糖飼料喂養(yǎng),考慮到PCOS是一種代謝異常的疾病,常合并糖脂代謝的異常,故在行藥物造模的同時常采用高脂高糖飼料喂養(yǎng),是否添加高脂高糖飲食與自己所研究的方向及目的相關。

3.4 模型評價 動物實驗模型成功的建立是前提,是進行下一步研究的基礎,只有動物的造模是成功的,其研究結果才有可信性。PCOS動物模型評價使用最多的是單純陰道涂片,此種方法簡單易行,可幫助判斷動物是否存在規(guī)律的性周期變化,是否處于無排卵狀態(tài)。如果連續(xù)2個性周期陰道上皮細胞持續(xù)角化現(xiàn)象,并失去規(guī)律的動情周期則提示無排卵。其次是采用生化指標評價,此種評價方法包括檢測性激素、生化指標等協(xié)同判斷模型的成功與否,較單純的陰道涂片更進一步。此外是病理學指標,病理主要是觀察卵巢的鏡下改變是否符合PCOS改變,一般是隨機抽取判斷。病理學指標是評價PCOS模型的Ⅰ類指標,可準確、直接說明PCOS的病變組織形態(tài)特點,權重系數(shù)0.4[5],光鏡下見卵巢呈多囊樣改變,白膜增厚,閉鎖卵泡數(shù)目增多,卵泡膜細胞層增厚,可見黃體和白體明顯減少。顆粒細胞層增厚,顆粒細胞層數(shù)減少,僅為數(shù)層,顆粒細胞排列致密、染色加深是PCOS典型表現(xiàn)。生化指標是Ⅱ類指標,PCOS模型建立后性激素及胰島素抵抗指數(shù)會出現(xiàn)變化,生化指標變化是PCOS發(fā)生、發(fā)展、康復過程的機體反映,也是模型成功與否的指征,但特異性稍低,權重系數(shù)為0.4[5]。表觀指標是Ⅲ類指標,PCOS最直接的判定標準是表觀指標的變化,模型建立后,可見模型動物閉經、體質量明顯增加、卵巢表面蒼白,卵巢包膜增厚明顯,體積增大,重量增大。根據(jù)表觀指標的特點,有利于模型的判斷,但由于其特異性不強,表觀指標權重系數(shù)0.2[5]。模型評價盡量選用權重系數(shù)較高的指標,雖然陰道脫落細胞涂片未被列入評價指標中,但因其方便快速,簡易可行被研究者廣泛采用。同時對模型評價不應局限于一種方法,可2種甚至3種方法聯(lián)合來判斷模型的成功與否。此外,造模后研究者時常進行治療藥物干預,在治療藥物干預期間,模型鼠是否會恢復正常狀態(tài)亦是需要考慮的問題,所以也有在治療藥物干預期間繼續(xù)進行造模藥物的使用,防止大鼠恢復排卵[19],保證疾病模型的持續(xù)存在,但是此種情況存在造模藥物的持續(xù)使用是否對治療藥物的治療效果產生影響的問題。

3.5 中醫(yī)證型選擇 方證對應是中醫(yī)辨證方法及理論的最終體現(xiàn),也是中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的最終落腳點。所以在對中醫(yī)藥進行實驗研究時,應考慮與中醫(yī)藥相對應的證型問題。在獲取的文獻中,有3篇專門針對中醫(yī)證型建立PCOS模型,雖然有的文獻提到痰濕證但其造模方法與非痰濕證模型并無明顯不同。此外亦有來曲唑聯(lián)合細菌內毒素法建立PCOS腎虛血瘀的模型[20]。臨床中患者中醫(yī)證型不同,其PCOS的表現(xiàn)及生物學指標不盡相同,在動物實驗時,尤其是涉及到中醫(yī)藥的研究,可能考慮到病證結合才能做到與臨床更為貼近,更加符合中醫(yī)藥的辨證論治,才能更好研究辨證用藥的作用機制,才會有更強的說服力。

綜上所述,PCOS造模采用最多的是雄激素及來曲唑構建模型,并且對于藥物劑量及干預時長較統(tǒng)一穩(wěn)定。在動物造模時盡量選用比較成熟的造模方法,以保證造模的成功,同時亦需要不斷地嘗試和探索新的造模方法,以求建立更符合臨床特征的PCOS動物模型。

利益沖突聲明:無。