徐海云 , 趙開樓 , 牛玉芝 , 王瑞鑫

(河南應用技術職業(yè)學院 化學工程學院 , 河南 鄭州 450042)

復雜的生活環(huán)境造成人體活性氧自由基的增多,過多自由基的存在不僅會導致人體的衰老,還會造成DNA損傷和腫瘤等多種疾病。而山藥具備一定的自由基清除能力,可以起到抗衰老和保健的醫(yī)療作用。目前國內外對山藥提取物的抗氧化活性研究很少,因此本文對山藥的抗氧化活性進行了研究。利用流動注射-化學分析法對山藥的抗氧化活性以及其對人體自由基清除能力的檢測和分析,對于造福人類具有深遠意義[1-3]。

本文重點研究了山藥中抗氧化活性物質的提取工藝,并利用化學發(fā)光分析法對提取液的抗氧化活性進行評價。用Cu2+-H2O2-luminol化學發(fā)光體系評價了山藥提取液對過氧化氫溶液的清除能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

魯米諾,0.01mol/L,98%,成都艾科達化學試劑有限公司;硫酸銅,0.01 mol/L,分析純,天津市永大化學試劑有限公司;過氧化氫溶液,0.1 mol/L,優(yōu)級純,國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸溶液,1 g/L,分析純,天津市永大化學試劑有限公司;碳酸鈉,分析純,煙臺市雙雙化工有限公司;碳酸氫鈉,分析純,煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設備

流動注射化學發(fā)光儀,IFFM-E,西安瑞邁分析儀器有限公司;高功率數(shù)控超聲清洗器,KQ-800KDE,昆山市超聲儀器有限公司;高速多功能粉碎機,CS-700,武義海納電器有限公司;循環(huán)水式真空泵,SHZ-D(Ⅲ),鞏義市英峪儀器廠;電熱恒溫水浴鍋,DK-98-1,天津市泰斯特儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥,DHG-9070A,上海-恒科學儀器有限公司;酸度計pHS-3C。

1.3 實驗方法

1.3.1山藥抗氧化活性成分的提取

將山藥切片、烘干、粉碎,進行4種不同因素的處理:稱取20份5 g山藥粉分別放置于20個100 mL錐形瓶中分4組。第1組加入100 mL蒸餾水,超聲30 min,在50 ℃下提取不同時間(0、1、2、3、5 h),定容至100 mL,待測。第2組加入100 mL蒸餾水,超聲30 min,在不同溫度下(40、50、60、70、80 ℃)下提取2 h,定容至100 mL,待測。第3組加入不同比例蒸餾水(料液比1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)超聲30 min,在50 ℃下提取2 h,定容至100 mL,待測。第4組加入50 mL不同溶劑(蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇)超聲50 min,在50 ℃下提取2 h,定容至100 mL,待測。

1.3.2山藥活性物質氧化能力的評價

流動注射化學發(fā)光法測定樣品抗氧化活性的原理為:樣品中的抗氧化活性成分能夠清除化學發(fā)光反應產生的自由基,而使體系的發(fā)光強度降低。依據(jù)發(fā)光強度的降低程度,可以對山藥提取液中抗氧化活性成分的含量進行分析。將魯米諾溶液和蒸餾水[維生素C(Vc)或待測液]由主蠕動泵泵入管路,過氧化氫溶液、硫酸銅溶液、鄰苯三酚溶液、碳酸鈉溶液由副蠕動泵泵入管路,混合器是各種溶液進行混合、發(fā)生化學發(fā)光反應的場所。之后,發(fā)光檢測器會將檢測到的發(fā)光信號在計算機上顯示出來。當魯米諾溶液和蒸餾水由主蠕動泵注入時,記錄發(fā)光強度為空白值I0;當注入Vc或待測液時,此時的發(fā)光強度為I;得到發(fā)光強度的降低值△I=I0-I,即可對山藥提取液的抗氧化活性進行分析。

2 結果與討論

2.1 評價體系的建立

2.1.1實驗原理

本實驗利用Cu2+- H2O2-魯米諾化學發(fā)光體系評價了山藥提取液對過氧化氫的清除能力。在堿性環(huán)境下,以Cu2+作催化劑,魯米諾與過氧化氫反應生成3-氨基鄰苯二甲酸陰離子。該陰離子可以吸收化學反應能量從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,當激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時會釋放出425 nm的光,從而產生發(fā)光信號。當反應體系中含有還原性物質時,可與過氧化氫發(fā)生反應,使過氧化氫濃度減小,從而使體系發(fā)光強度減弱,以此來評價待測物的抗氧化活性,反應過程見圖1。

圖1 流動注射化學發(fā)光流路圖

2.1.2魯米諾濃度的影響

本實驗研究魯米諾濃度對Cu2+-過氧化氫-魯米諾化學發(fā)光體系發(fā)光強度的影響。固定過氧化氫濃度為1×10-3mol/L,pH值=11,硫酸銅濃度為8×10-6mol/L,然后分別測定不同濃度的魯米諾下的化學發(fā)光強度。以魯米諾的濃度為橫坐標,發(fā)光強度I為縱坐標作圖,其結果如圖2所示。

圖2 不同魯米諾濃度發(fā)光強度曲線

由圖2可以看出,隨著魯米諾濃度增大,體系的化學發(fā)光強度先增強后減弱,當魯米諾濃度為6×10-4mol/L時,化學發(fā)光強度最大,因此本實驗選用最佳魯米諾濃度是6×10-4mol/L。

2.1.3pH值的影響

本實驗研究pH值對Cu2+-過氧化氫-魯米諾化學發(fā)光體系發(fā)光強度的影響。固定魯米諾濃度為6×10-4mol/L,過氧化氫濃度為1×10-3mol/L,硫酸銅濃度為8×10-6mol/L,然后分別測定一定pH值時體系的發(fā)光強度。以魯米諾溶液的pH值為橫坐標,發(fā)光強度I為縱坐標作圖,實驗結果見圖3。

圖3 不同pH值發(fā)光強度曲線

由圖3可知,pH值在9.5～12,其化學發(fā)光強度隨pH值的增加先增加后下降,當魯米諾溶液pH值為11時,發(fā)光強度最大,因此,本實驗選用最佳pH值是11。

2.1.4硫酸銅溶液濃度的選擇

本實驗研究硫酸銅濃度對Cu2+-過氧化氫-魯米諾化學發(fā)光體系發(fā)光強度的影響。固定過氧化氫濃度為1×10-3mol/L,pH值=11,魯米諾濃度為6×10-4mol/L,分別測定銅離子一定濃度下體系的發(fā)光強度,以銅離子濃度為橫坐標,發(fā)光強度值I為縱坐標作圖,實驗結果如圖4所示。

圖4 不同銅離子濃度發(fā)光強度曲線

由圖4可知,隨著銅離子濃度的增大,其化學發(fā)光強度一直在增大,當銅離子濃度為4×10-5mol/L時,此時的發(fā)光強度已足夠大,因此,本實驗選最佳銅離子濃度為4×10-5mol/L。

2.1.5過氧化氫濃度的選擇

本實驗研究過氧化氫濃度對體系發(fā)光強度的影響。固定Cu2+濃度為4×10-5mol/L,pH值=11,魯米諾濃度為6×10-4mol/L。然后分別測定H2O2一定濃度下體系的發(fā)光強度,以過氧化氫溶液的濃度為橫坐標,發(fā)光強度值I為縱坐標作圖,實驗結果如圖5所示。

圖5 不同過氧化氫濃度發(fā)光強度曲線

由圖5可知,過氧化氫濃度在4×10-4～8×10-3mol/L內,隨著過氧化氫溶液濃度的增大,體系的發(fā)光強度先增大后減小,當過氧化氫濃度為8×10-4mol/L時,體系的發(fā)光強度最大,因此,本實驗選用最佳過氧化氫濃度是8×10-4mol/L。

2.1.6Cu2+-H2O2-魯米諾化學發(fā)光體系的標準Vc曲線

通過上述實驗,選用pH值=11,魯米諾濃度為6×10-4mol/L,過氧化氫濃度為8×10-4mol/L,銅離子濃度為4×10-5mol/L的條件下,測定Vc對自由基的抑制能力。選取一定濃度Vc標準溶液,以Vc的濃度為橫坐標,發(fā)光強度變化值ΔI為縱坐標作標準曲線。實驗結果如圖6、圖7所示。

圖6 1～15 mg/L內標準Vc曲線

圖7 20～80mg/L內標準Vc曲線

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1提取時間的影響

將之前不同提取時間的山藥提取液離心,取上清液,采用小針管吸取2 mL,稀釋至100 mL,根據(jù)圖1的化學發(fā)光儀器流路對其進行檢測,得到ΔI隨不同提取時間的影響。并利用標準曲線公示進行處理,與Vc進行比對,結果如圖8所示。

圖8 不同提取時間的抑制能力

由圖8可知,山藥的抗氧化能力與提取時間有關,時間越長,提取液對氧自由基的清除能力就越大,因此本實驗的最佳提取時間是5 h。

2.2.2提取溫度的影響

將之前不同提取溫度的山藥提取液離心,取上清液,采用小針管吸取2 mL,稀釋至100 mL,根據(jù)圖1的化學發(fā)光儀器流路對其進行檢測,并得出不同溫度的對比抑制力,結果如圖9所示。

圖9 不同提取溫度的抑制能力

由圖9可知,山藥抗氧化能力與提取溫度有關,隨著溫度升高,提取液對氧自由基的清除能力先增強后減弱,當提取溫度為50 ℃時,抗氧化能力最強。因此本實驗的最佳提取溫度是50 ℃。

2.2.3料液比的影響

將之前不同提取料液比的山藥提取液離心,取上清液,采用小針管吸取2 mL,稀釋至100 mL,根據(jù)圖1的化學發(fā)光儀器流路對其進行檢測,并得出不同料液比的化學發(fā)光抑制力曲線如圖10所示。

由圖10可知,山藥抗氧化能力與提取時料液比有關,隨著料液比的改變,提取液對氧自由基的清除能力也在改變,當料液比為1∶10時,抗氧化能力最強。因此本實驗的最佳提取料液比是1∶10。

2.2.4不同溶劑的影響

將之前不同提取溶劑的山藥提取液離心,取上清液,采用小針管吸取2 mL,稀釋至100 mL,根據(jù)圖1的化學發(fā)光儀器流路對其進行檢測,并得出不同溶劑的化學發(fā)光抑制力曲線如圖11所示。

圖11 不同溶劑的抑制能力

由圖11可知,山藥抗氧化能力與提取溶劑有關,隨著溶劑的改變,提取液對氧自由基的清除能力也在改變,當溶劑為40%乙醇時,抗氧化能力最強。因此本實驗的最佳提取溶劑是40%乙醇。

3 結論

在Cu2+-H2O2-Luminol化學發(fā)光體系下,以Vc作為抗氧化活性評價的參照物,優(yōu)化化學發(fā)光體系,繪制Vc標準曲線;依據(jù)線性回歸方程,利用化學發(fā)光分析法,考察了山藥提取液的最佳提取工藝及抗氧化能力。

綜上所述, Cu2+-H2O2-Luminol化學發(fā)光體系優(yōu)化后的條件為:pH值=11,魯米諾濃度為6×10-4mol/L,銅離子濃度為4×10-5mol/L,H2O2濃度為8×10-4mol/L。以該體系優(yōu)化后的條件,來評價山藥提取液的抗氧化活性。以蒸餾水為提取劑時,最佳的提取工藝為:在50 ℃下采用1∶10的料液比,超聲30 min提取5 h。選用乙醇作為提取劑時,40 %的乙醇具有最佳的提取效果。