鄧云烜,丁威威,劉寶晨,楊 超,解廷斌

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)普通外科研究所,南京 210000

腹腔感染(intra-abdominal infection,IAI)是腹部創(chuàng)傷治療中的關(guān)鍵問題,其挑戰(zhàn)性來源于病原體的多樣性、耐藥性增加以及患者的復(fù)雜生理反應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計,IAI是腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因[2],因此早期診斷與干預(yù)有助于改善患者預(yù)后。

IAI患者通常會接受預(yù)防性或治療性的抗生素使用,腹腔及血液樣本中的病原體數(shù)量往往偏低,因此直接涂片鏡檢不適用;其次,由于許多病原體的抗原存在變異,缺乏特異性的檢測抗體對其進行識別,血清學(xué)檢測方法應(yīng)用有限[3];而分子生物學(xué)診斷方法雖然可從基因水平上對病原體進行鑒定,但由于腹腔感染的病原體種類繁多且構(gòu)成不確定,預(yù)設(shè)感染病原體進行驗證性診斷無法確保診斷的全面性,因此適用性不強[4]?，F(xiàn)階段,臨床應(yīng)用最為廣泛的仍然是微生物培養(yǎng)方法,也是感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn),培養(yǎng)得到的菌株可以進行生化反應(yīng)、藥敏試驗等進一步分析,為臨床提供有價值的信息,但培養(yǎng)方法的周期長,且受限于樣本質(zhì)量(微生物數(shù)量及類別),陽性率往往偏低。因此,亟需一種不依賴于微生物表型的檢驗技術(shù)以提高病原體診斷效率。

近年來,宏基因組二代測序(meta-genomic next-generation sequencing,mNGS)作為新興的微生物鑒定和傳染病診斷技術(shù),以其快速、高效、無偏檢測微生物的優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于臨床感染性疾病的診療[5]。在符合推薦適應(yīng)證的情況下,mNGS對不同感染性疾病的診斷價值存在差異[6],但其在腹部創(chuàng)傷合并IAI的診療中仍具有較大潛在價值。因此,本研究旨在描述mNGS對腹部創(chuàng)傷合并IAI診療的影響并評估其臨床診斷價值。

資料與方法

1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究回顧分析2020年8月—2022年4月收住南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院普通外科ICU的腹部創(chuàng)傷疑似合并IAI的患者110例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲的腹部創(chuàng)傷患者,簡明損傷定級標(biāo)準(zhǔn)(abbreviated injury scale,AIS)評分≥3分;(2)根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及實驗室檢查診斷為疑似/存在IAI,且病情較危重,符合《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》(下文簡稱共識)[7]中所推薦的臨床適應(yīng)證;(3)樣本:通過局部穿刺、手術(shù)或腹腔引流管留取腹腔引流液(peritoneal drainage,PD)樣本,同時留取外周靜脈血樣本;(4)檢測方法:同時進行血液及PD微生物培養(yǎng)與mNGS。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)病例資料缺失;(2)合并嚴(yán)重顱腦損傷(頭部AIS評分≥3分)。疑似IAI診斷標(biāo)準(zhǔn):病史、查體、實驗室檢查、影像學(xué)檢查及穿刺等[8]。確診依賴于陽性病原學(xué)檢測結(jié)果。收集患者的人口學(xué)資料及臨床基線參數(shù),包括損傷情況、感染診斷、血液炎癥指標(biāo)、mNGS和微生物培養(yǎng)的檢測結(jié)果以及治療調(diào)整情況?；颊呔押炇鹬橥鈺?本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2020NZKY-011-01)。

2 樣本檢測

收集的標(biāo)本在采集后4h內(nèi)送至臨床微生物實驗室進行微生物培養(yǎng)。將同時留取的另一份標(biāo)本置于干冰保存進行mNGS檢測。使用QIAamp DNA微量試劑盒(凱杰,希爾登,德國)從樣本中提取DNA,然后以QIAseq超低輸入文庫試劑盒(Illumina,加利福尼亞州,美國)構(gòu)建DNA文庫;使用Qubit(賽默飛世爾,馬薩諸塞州,美國)和安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技,馬薩諸塞州,美國)評估文庫質(zhì)量,高質(zhì)量文庫在NextSeq 500平臺(Illumina,加利福尼亞州,美國)上進行循環(huán)測序,每個循環(huán)均設(shè)陰性和陽性對照。之后進行數(shù)據(jù)分析,去除較短或低質(zhì)量的序列,并與人類參考基因數(shù)據(jù)庫(hg38)對比后,進一步過濾人源DNA,最終剩余的序列與美國國家生物信息中心微生物基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes)進行比對。

3 感染性病原體的定義

感染性病原體為文獻報道的具有致病性的微生物,并且致病特點與臨床癥狀相符,并排除污染。由于病毒和支原體不是常見的IAI病原體,本研究不包括mNGS檢測到的病毒和支原體。如果測定細(xì)菌或真菌滿足以下mNGS閾值之一,則判定為陽性:(1)細(xì)菌或真菌的相對豐度>30%;(2)組織病理學(xué)檢查和(或)微生物培養(yǎng)陽性;(3)血液及PD均檢測到符合致病特點的病原體;(4)單種細(xì)菌>50個特異序列,單種真菌>1個特異序列。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 患者納入及臨床資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn),共有43例嚴(yán)重腹部創(chuàng)傷存在/疑似合并IAI患者納入研究,其中4例因臨床資料不完整被排除,2例因存在嚴(yán)重顱腦損傷被排除,最終納入37例。根據(jù)微生物培養(yǎng)以及mNGS檢測結(jié)果,最終確診IAI患者32例,非IAI患者5例(圖1)?；颊叩娜丝趯W(xué)及臨床資料比較見表 1。IAI組中,患者的損傷嚴(yán)重程度較高,ISS為19(14,27)分,取檢時間為13(7,24)d,感染原因的前三位依次為腸瘺(n=11)、腹腔殘余感染(n=10)及胰腺周圍組織感染(n=7)。IAI組與非IAI組相比,取檢時間更長,APACHE II評分更高,ICU住院時間更長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

SICU:外科重癥監(jiān)護室;AIS:簡明損傷定級標(biāo)準(zhǔn);PD:腹腔引流液;IAI:腹腔感染

表1 納入患者的人口學(xué)及臨床資料比較[M(P25,P75),n]

2 不同檢測方法的診斷效能比較

筆者對四種檢測方法的診斷性能進行評估,包括PD微生物培養(yǎng)、PD mNGS、血液微生物培養(yǎng)及血液mNGS。對于陽性結(jié)果報告時間,mNGS較微生物培養(yǎng)顯著縮短(22.0hvs.61.5h,P<0.05),見圖2。在診斷IAI方面,PD mNGS顯示出較高的靈敏度及陰性預(yù)測值(均為1.000),微生物培養(yǎng)僅為0.343及0.192,但PD mNGS特異度(0.600)及陽性預(yù)測值(0.941)低于PD微生物培養(yǎng),特異度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2),兩種方法診斷IAI的受試者工作曲線(receiver operating curve,ROC)的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.800及0.672(P<0.05),見圖3。血液微生物培養(yǎng)的陽性預(yù)測值及特異度均為1.000,陰性預(yù)測值為0.147,靈敏度為0.094。血液mNGS的陽性預(yù)測值為0.964,診斷特異度為0.800,與血液微生物培養(yǎng)無明顯差異(P>0.05);陰性預(yù)測值為0.444,靈敏度為0.843,均高于血液微生物培養(yǎng)方法,其中靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),兩種方法診斷IAI的ROC的AUC分別為0.822及0.547(P<0.05)。

mNGS:宏基因組二代測序;****P<0.001

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測序;IAI:腹腔感染;ROC:受試者工作曲線

表2 不同檢測方法對IAI診斷效能的比較(95%CI)

3 IAI患者的病原學(xué)結(jié)果分析

對32例確診IAI患者的微生物培養(yǎng)及mNGS檢出病原體進行分析,血液及PD mNGS病原體的檢出率分別為75.0%(24/32)及90.6%(29/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)。且檢出病原體類別多于微生物培養(yǎng),去除對IAI意義不明的病毒以及支原體后,共檢出革蘭氏陰性菌36種,革蘭氏陽性菌11種,真菌10種,檢出率前三的革蘭氏陰性菌依次為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌及大腸埃希菌,檢出率最高的革蘭氏陽性菌為腸球菌屬,真菌為念珠菌屬。在兩種樣本中,mNGS對各病原體的檢出率均高于或等于培養(yǎng)方法,血液樣本中,肺炎克雷伯菌差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PD樣本中,肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

PD:腹腔引流液;mNGS:宏基因組二代測序

根據(jù)陽性病原體的診斷標(biāo)準(zhǔn)對檢測結(jié)果進行分析,確定可能的致病微生物構(gòu)成,mNGS對革蘭氏陽性菌的檢出率為46.9%(15/32),對真菌的檢出率為43.8%(14/32),對多病原體的混合感染檢出率為84.4%(27/32),均顯著高于微生物培養(yǎng)方法(28.1%,P<0.05)。見圖5。

mNGS:宏基因組二代測序;*P<0.05,***P=0.001

4 mNGS代表性病例

在病例3中,患者PD呈現(xiàn)明顯膿性,mNGS結(jié)果中星座鏈球菌未達陽性標(biāo)準(zhǔn),棲牙普雷沃菌為口腔定植菌,無引起IAI相關(guān)報道。因此,PD微生物培養(yǎng)更符合患者病史及臨床表現(xiàn),mNGS出現(xiàn)假陽性結(jié)果可能與取檢不規(guī)范或不一致有關(guān)。在病例32中,患者存在發(fā)熱及腹腔積液,PD及血液mNGS均檢出大量厭氧菌,并非IAI常見致病菌,同時,正常人血液中含有少量厭氧菌核酸,因此判斷患者并非IAI。在病例37中,PD mNGS顯示存在多種病原體,其中只有銅綠假單胞菌相對豐度>30.0%,血液mNGS檢出的鳥腸球菌特異序列數(shù)偏低,同時由于患者胰周感染嚴(yán)重,因此認(rèn)為銅綠假單胞菌及屎腸球菌為責(zé)任微生物。

在病例15中,患者腹部術(shù)后反復(fù)高熱,且存在高位脊柱損傷,自主呼吸無力,疑似感染源為腹腔及呼吸系統(tǒng),進行血液及PD mNGS檢測發(fā)現(xiàn),血液中存在鮑曼不動桿菌,PD中存在序列數(shù)較少的腸道細(xì)菌,后續(xù)肺泡灌洗液微生物培養(yǎng)也提示存在大量鮑曼不動桿菌,因此排除IAI,針對肺部感染強化治療。在病例18中,患者為腹部受擊后不明原因引起的腹膜后膿腫,術(shù)中PD及外周血mNGS提示存在大量魚腥味錐形桿菌,查閱資料知該菌為口腔致病菌,產(chǎn)硫化氫,與術(shù)中膿腔大量惡臭膿液相符,進一步檢查患者口腔發(fā)現(xiàn)存在較多齲齒且入院前一周有過高熱,因此推斷患者為免疫低下致血行感染而繼發(fā)后腹膜血腫感染。見表3。

表3 部分代表性病例病原學(xué)信息

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷導(dǎo)致機體生理功能紊亂和免疫機能下降,隨著病原體暴露風(fēng)險的增加,感染發(fā)生率較高[9]。據(jù)統(tǒng)計,腹部創(chuàng)傷患者晚期死亡的主要原因為IAI[1]。因此,對感染早期識別與針對性治療,對改善患者的預(yù)后至關(guān)重要,同時凸顯了病原體鑒定技術(shù)在感染診療中的關(guān)鍵作用。

在目前臨床常用的微生物檢測方法中,血清學(xué)檢驗存在交叉反應(yīng)和抗原變異的問題,熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)需要預(yù)設(shè)病原體類別進行篩選,涂片鏡檢則缺乏特異性。因此,微生物培養(yǎng)仍然是IAI臨床診療中應(yīng)用最廣泛的微生物分離鑒定技術(shù),但存在陽性率低、時效性差等問題[10],限制了抗生素的合理使用。

本研究顯示,與微生物培養(yǎng)相比,mNGS的結(jié)果反饋時間短,診斷時效性更強。同時,mNGS受預(yù)先抗生素使用的影響較小,對IAI的識別能力顯著優(yōu)于微生物培養(yǎng)。此外,mNGS識別病原體的種類及數(shù)目顯著多于微生物培養(yǎng),與本研究結(jié)果一致,其無偏檢測病原體的特性使其對混合感染的識別能力較強[5],其中真菌、革蘭氏陽性菌等類別病原體的檢出對指導(dǎo)抗生素使用具有重要價值。

既往研究顯示,臨床血液微生物培養(yǎng)陽性百分比呈下降趨勢,陽性率最低至9.9%[11],本研究中血液微生物培養(yǎng)陽性率僅為9.4%(3/32),這可能是由于大部分患者已預(yù)先使用廣譜抗生素,降低了血液中病原體的數(shù)量。Miao等[12]發(fā)現(xiàn)抗生素使用對mNGS結(jié)果影響較小,表明致病微生物的核酸可在患者血液中留存更長的時間。在本研究中,血液mNGS顯示出更高的陽性率(28/32,87.5%)和較好的診斷性能,在預(yù)先抗生素使用的情況下,即便是常規(guī)容易微生物培養(yǎng)的病原體,mNGS仍然具有更強的檢測能力。因此,對于抗生素使用時間較長的感染患者,mNGS是一種較為理想的選擇。

雖然PD和血液mNGS均顯示出較高的診斷靈敏度,但mNGS的結(jié)果解讀仍然存在困難[7]。在IAI中,多病原體及罕見病原體的檢出十分普遍,如何判斷它們對感染的貢獻是目前該技術(shù)臨床應(yīng)用的一大難點[5,7]。2021年一項多中心回顧性隊列研究顯示,82例血液mNGS陽性率雖達到61%,但僅在7.3%的病例中產(chǎn)生了積極影響。說明當(dāng)檢出結(jié)果不足以對現(xiàn)有治療產(chǎn)生影響,以及無法完全明確檢出結(jié)果是否疾病驅(qū)動因素時,該技術(shù)的臨床價值有限[6]。2021年初發(fā)布的中國專家共識也指出了這一問題,并對相關(guān)概念、適應(yīng)證及檢測流程進行了規(guī)范,但因?qū)嶒炇壹凹膊〔町?并未對陽性閾值做出明確推薦[7],因此仍需要更多元的研究進一步積累相關(guān)數(shù)據(jù)。共識也指出,對于核酸提取破壁困難的如真菌(如曲霉菌、毛霉菌、隱球菌等),即使特異序列數(shù)較少也應(yīng)當(dāng)考慮為致病菌,并進行三方驗證[7]。本研究中對于多病原體同時存在的情況,依據(jù)文獻中較多使用的標(biāo)準(zhǔn)對相對豐度低(<30%)、特異序列數(shù)少(<50個)、臨床致病性不明確及潛在污染病原體(如表皮葡萄球菌、部分單胞菌屬等)予以去除[13],同時針對本中心患者病程特點,將真菌陽性標(biāo)準(zhǔn)進行了放寬(>1個特異序列數(shù))。目前有部分研究通過微生物引起的特異性免疫反應(yīng)與細(xì)胞因子變化,或是代謝物分析、生物信息學(xué)分析和微生物組分析來探究致病微生物所引起的特異性改變,以區(qū)分致病與定植、污染微生物,提高診斷準(zhǔn)確性,但尚需要相關(guān)的臨床研究來表明其實際區(qū)分能力[14-15]。

由于病情及評價標(biāo)準(zhǔn)的差異,目前對mNGS臨床獲益的研究結(jié)果不一[6,16]。在本研究中,將病原體檢測結(jié)果進行評估篩選后,對現(xiàn)有抗生素抗菌譜覆蓋不足的病例進行了調(diào)整;但對于檢出窄譜病原體的病例,考慮到治療風(fēng)險,在患者感染源及感染癥狀未充分控制前,并未進行相應(yīng)的調(diào)整。而對于醫(yī)院常見病原體的檢出,在綜合患者病史、臨床表現(xiàn)及抗感染治療反應(yīng)等信息后,筆者對細(xì)菌耐藥性進行了推斷,并在此基礎(chǔ)上進行不同抗菌活性抗生素的調(diào)整。雖然目前部分mNGS報告中增加了對耐藥基因信息的描述,但基因定位和表型存在等問題尚未完全解決,因此僅能作為參考,具體推斷仍需結(jié)合臨床。

本研究也存在一些不足。首先,微生物培養(yǎng)和mNGS都缺乏客觀的標(biāo)準(zhǔn)來確定檢測到的致病微生物是來自感染、定殖還是污染,而是依賴于臨床醫(yī)師的主觀判斷,這在結(jié)果解釋性上存在不足。其次,研究沒有在基因水平上用額外的分子方法進行驗證。第三,研究為單中心回顧性研究,數(shù)據(jù)有限且積累不受研究者控制而存在偏倚。

本研究顯示,對于腹部創(chuàng)傷合并IAI的患者,mNGS的總體診斷性能優(yōu)于微生物培養(yǎng)方法,且在診斷混合感染及罕見病原體感染方面具有獨特的優(yōu)勢,隨著技術(shù)的成熟與成本的降低,有望改變現(xiàn)有IAI的診療范式,促進個體化的精準(zhǔn)治療。未來需進一步的前瞻性研究表明mNGS的臨床價值。

作者貢獻聲明：鄧云烜:研究構(gòu)思及設(shè)計、文獻調(diào)研;數(shù)據(jù)收集、整理、分析及文章撰寫;丁威威、劉寶晨:研究構(gòu)思及設(shè)計;楊超:文章修改和審查;解廷斌:結(jié)果解釋