羅長琴，肖國生，蔣忠岑，樊汶樵，吳英

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 萬州 404100； 2.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 萬州 404100；3.重慶文理學(xué)院，重慶 永川 402160）

黃精為百合科（LiliaceaeJuss.）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，為藥食兩用植物，以根莖入藥［1］。目前全世界普遍認(rèn)可的黃精屬有87種，主要分布于北溫帶和北亞熱帶國家，我國有40余種，廣泛分布于32個(gè)省級(jí)行政區(qū)［2-3］，其中西南地區(qū)（四川省、重慶市、云南省、貴州省等）多達(dá)23種，是黃精屬植物的熱點(diǎn)地區(qū)和多樣性中心［4］。黃精性平味甘，具有潤肺健脾，滋陰益腎，提高機(jī)體免疫力及降糖、降脂、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用，常用于治療脾虛胃弱、糖尿病、高血糖、高血脂、高血壓等疾?。?-6］。目前對(duì)黃精的文獻(xiàn)報(bào)道多集中在多糖類和甾體皂苷類［7-9］，對(duì)氨基酸類化合物的研究較少。氨基酸作為人體合成蛋白質(zhì)和形成多種酶、抗體及激素的原料［10］，具有調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)代謝和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用［11］。王俊杰等人［12］研究發(fā)現(xiàn)黃精中富含18種氨基酸，具有可觀的食用價(jià)值。

目前氨基酸的檢測方法主要包括氣相色譜法、氨基酸自動(dòng)分析儀法、高效液相色譜法、離子色譜法等［13-14］，其中氨基酸自動(dòng)分析儀法，能實(shí)現(xiàn)柱后在線衍生，具有操作簡單、快捷、安全和準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢。因此本研究采用氨基酸自動(dòng)分析儀法對(duì)野生黃精的氨基酸類成分進(jìn)行含量分析，為后續(xù)黃精在食品、保健食品的深入開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器

S433D全自動(dòng)氨基酸測定儀（塞卡姆科學(xué)儀器有限公司）；QUINTIX224-1CN分析天平（德國賽多利斯公司）；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)（美國Millipore公司）；SIGMA 3-30離心機(jī)（德國SIGMA公司）；Turbovaplv氮吹儀（瑞典Biotage公司）；BPGP240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科儀器有限公司）；PB-21型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；IKAMS3 digital渦旋儀（德國IKA公司）；KQ-800DB數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 主要試劑

檸檬酸三鈉、硼酸、乙酸鉀、三水乙酸鈉、茚三酮、苯酚（優(yōu)級(jí)純，成都市科龍化學(xué)品有限公司）；鹽酸、檸檬酸、無水乙醇（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；氫氧化鈉、乙酸（優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸鈉、抗壞血酸（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司）。

17種氨基酸混標(biāo)（天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絡(luò)氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸）濃度為2.5 μmol/L（胱氨酸為1.25 μmol/L），購自德國塞卡姆公司。

1.1.3 樣品采集與制備

從重慶市奉節(jié)縣、萬州區(qū)、梁平區(qū)、石柱縣、巫山縣等地采集野生黃精根莖樣品34份，以湖北省襄陽市種植黃精根莖樣品作為參比樣品。將樣品清洗后切成約1 mm厚的薄片，置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h，冷卻后用研磨儀制成粉末狀，備用。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

吸取氨基酸混標(biāo)1.00 mL至10 mL容量瓶中，用樣品稀釋液（pH 2.20的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖溶液）定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)中間液，再分別吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、2.00 mL至于10 mL容量瓶中，用樣品稀釋液定容至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線系列。

1.2.2 樣品溶液的配制

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定方法》［15］，稱取樣品0.5 g（精確至0.0001 g）于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，加蓋，渦旋30 s，置入135℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解4 h，取出用純水沖洗水解液至50 mL容量瓶中，并定容至50 mL，混勻，8000 r/min離心5 min備用。取上清液0.20 mL于氮吹管中，50℃水浴氮吹至近干，再加0.50 mL純水氮吹至近干，加入樣品稀釋液1.00 mL復(fù)溶，超聲至殘?jiān)芙?，過0.45 μm水相濾膜，待測。

1.2.3 儀器方法

色譜柱：氨基酸專用柱（4.6 mm × 150 mm，7 μm）；進(jìn)樣量：50 μL，波長：440 nm和570 nm；衍生試劑：20 g/L茚三酮溶液；流動(dòng)相：A為pH 3.45的檸檬酸鈉-檸檬酸溶液；B為pH 10.85的檸檬酸鈉-氫氧化鈉溶液；C為200 g/L氫氧化鈉溶液；流動(dòng)相的梯度比例和流速詳見表1，衍生試劑的梯度升溫和流速詳見表2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution table of mobile phase

表2 衍生試劑梯度升溫度表Tab.2 Gradient temperature rise table of derivative reagents

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，按照“1.2.3”中的方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液在570 nm處檢出的16種氨基酸和在440 nm處檢出的脯氨酸均能達(dá)到良好的分離度；樣品溶液在目標(biāo)峰處均無雜質(zhì)峰干擾，說明該方法具有良好的專屬性，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）中17種氨基酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of 17 amino acids in standards and samples

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)性

取上述“1.2.1中配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.2.3”中的方法進(jìn)行測定，以各種氨基酸溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，17種氨基酸在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r：0.9985～0.9999），詳見表3。

2.1.3 精密度測定

取同一濃度樣品溶液，平行測定6次，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示各氨基酸的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）為0.01%～0.09%；峰面積的RSD為0.20%～0.88%，說明儀器的精密度良好，詳見表4。

2.1.4 重復(fù)性測定

稱取同一批次黃精樣品6份，按照“1.2.2”進(jìn)行前處理，制成6份樣品溶液，按“1.2.3”中的方法進(jìn)行測定，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果顯示各氨基酸保留時(shí)間的RSD為0.12%～0.55%；樣品中氨基酸含量的RSD為0.80%～2.00%，表明該方法重復(fù)性較好，見表4。

2.1.5 回收率測定

精密稱取黃精樣品6份，每份約0.2 g，置于50 mL離心管中，分別精密加入17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1.00 mL，按照“1.2.2”進(jìn)行前處理，制成6份樣品溶液，按“1.2.3”中的方法進(jìn)行測定，17種氨基酸的平均回收率為83.28%～91.08%，見表4。

2.2 野生黃精樣品中氨基酸的含量分析

野生黃精檢出17種氨基酸，氨基酸總量為7.161 ± 3.488 g/100 g，與方樂霞等［16］測定結(jié)果7.83%相近。其中谷氨酸和組氨酸含量較高，分別占比27.94%、14.94%；含量較低的為胱氨酸0.050 ±0.030 g/100g和異亮氨0.071 ± 0.037 g/100 g，見表5。必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）是人體不能合成或合成速度遠(yuǎn)不能適應(yīng)機(jī)體需要，必需由食物蛋白質(zhì)供給的氨基酸，有很高的利用價(jià)值。野生黃精中共檢出7種EAA，總含量為2.090 ± 1.034 g/100g，其中賴氨酸占比最高，高達(dá)37.42%。樣品中EAA與總氨基酸（Total amino acid，TAA）含量的比值為29.6% ± 5.1%，EAA與非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA）比值為42.8% ± 10.7%，與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織、世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)中EAA/TAA比值40%、EAA/NEAA比值60%相比，均還有差距［17］。由表6可知，氨基酸種類之間大多數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.01），最高的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)在纈氨酸和亮氨酸間，高達(dá)0.980，與劉彥東等［18］測定黔產(chǎn)黃精中纈氨酸和亮氨酸間相關(guān)系數(shù)0.976相吻合；而半胱氨酸與谷氨酸、纈氨酸之間分別呈負(fù)相關(guān)性，最低的相關(guān)系數(shù)僅為-0.014。

表5 野生黃精根莖中氨基酸含量情況Tab.5 The amino acids content of wild P. sibiricum

表6 氨基酸種類間相關(guān)性分析Tab.6 Correlation analysis among different amino acids

對(duì)野生黃精根莖中氨基酸成分進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，選取了3個(gè)主成分，特征值分別為10.987、2.371、1.041，貢獻(xiàn)率分別為64.631%、13.944%、6.125%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為84.701%，見表7。各主成分對(duì)氨基酸指標(biāo)的載荷和評(píng)分系數(shù)見表8，第一主成分代表性氨基酸主要包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸和脯氨酸，第二主成分代表性氨基酸主要包括賴氨酸和苯丙氨酸，第三主成分代表性氨基酸主要包括精氨酸和絡(luò)氨酸。

表7 主成分的初始特征值及累積方差貢獻(xiàn)率Tab.7 Initial eigenvalues and cumulative variance contribution of principal components

表8 氨基酸類主成分載荷和評(píng)分系數(shù)Tab.8 Factor load and score coefficieni matrin of princial components of amino acids

2.3 不同區(qū)縣野生黃精根莖中氨基酸含量分析

對(duì)各個(gè)產(chǎn)地樣品中TAA含量分析發(fā)現(xiàn)，巫山地區(qū)樣品中的含量最高，其他依次為萬州、石柱、奉節(jié)、梁平，但各個(gè)產(chǎn)地差異不顯著。TAA含量最高（17.4 g/100 g）和最低（3.185 g/100 g）的樣品，均采自奉節(jié)，見表9。其中，石柱地區(qū)樣品中的EAA含量為2.632 ± 0.272 g/100 g，排第一，梁平的最低，為1.833 ± 0.169 g/100 g。對(duì)于EAA與TAA含量的比值，最高的為巫山31.4% ± 6.3%，最低的為萬州25.4% ± 2.2%；但各個(gè)產(chǎn)地的EAA、NEAA、TAA含量差異不顯著，詳見表9。

表9 不同區(qū)縣野生黃精根莖中總氨基酸含量結(jié)果與分析Tab.9 Results and analysis of total amino acids in rhizomes of wild P. sibiricum from different districts and counties

3 結(jié)論

本研究在黃精樣品中加入6 mol/L鹽酸溶液于135℃水解4 h，經(jīng)氮吹后復(fù)溶，利用全自動(dòng)氨基酸測定儀定量測定游離和水解氨基酸總和。結(jié)果表明野生黃精樣品中檢出17種氨基酸，包括7種必需氨基酸；其中谷氨酸和組氨酸含量較高，兩者之和占氨基酸總量的比例高達(dá)43%；氨基酸種類之間存在正相關(guān)關(guān)系，對(duì)不同產(chǎn)地黃精根莖中氨基酸含量分析結(jié)果表明，巫山地區(qū)樣品中氨基酸含量較高。結(jié)果表明，渝產(chǎn)野生黃精的氨基酸種類豐富，含量可觀，后續(xù)可對(duì)其生長環(huán)境的土壤、溫度、濕度做相關(guān)性分析，為優(yōu)質(zhì)黃精的選種和種植提供基礎(chǔ)。