朱 海，鄭夢澤，賈瑋瑋，周 倩，談 帥，劉子昂，張傳志，王偉玲，李婷婷,

（1.江蘇海洋大學，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005；3.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇連云港 222005）

限制性內(nèi)切酶是分子生物學中最常用的工具酶之一[1]，其中，Ⅱ型限制性內(nèi)切酶在識別序列的內(nèi)部或附近確定位點對DNA 進行特異性切割，由于其穩(wěn)定的裂解模式及簡便的催化方式而被廣泛應(yīng)用于基因重組等分子生物學領(lǐng)域，具有重要的商業(yè)價值[2]。根據(jù)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶在識別序列上的不同，可以將其分為不同的亞類：例如，以EcoR I、Hind III 為代表的ⅡP 型內(nèi)切酶，可以識別回文序列，并在識別序列內(nèi)部進行對稱切割；以Bsa I、Fok I 為代表的ⅡS 型，可以識別不對稱序列，并在識別序列一端的固定位置進行切割[3-4]。

Bsa I 是一種來源于嗜熱芽孢桿菌的ⅡS 型限制酶，可以特異性識別不對稱DNA 序列5’-GGTCTC-3’，并在識別序列3’端第1 個堿基N1 后，以及識別的互補序列3’-CCAGAG-5’的5’端第5 個堿基N5后切割，從而留下4 個堿基的5’突出端[5-6]。常用于Golden Gate 組裝（Golden Gate Assembly）以及mRNA疫苗用質(zhì)粒的線性化或其它體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的線性化[7-10]。Bsa I 作為基因敲除的工具，在揭示植物基因功能和作物改良方面具有舉足輕重的作用[11-13]。天然來源的限制酶使用往往具有局限性，比如活性低，星號活性明顯，使用條件苛刻等[14-15]。這些局限性極大地影響了內(nèi)切酶在商業(yè)化中的應(yīng)用，所以研究者對于天然限制酶的研究和改造一直都沒有停止。為了克服天然酶存在的問題，針對Bsa I 進行結(jié)構(gòu)研究具有重要意義。

X 射線晶體衍射是解析生物大分子三維結(jié)構(gòu)的主要手段之一。其主要過程包括數(shù)據(jù)收集、相位解析、初始電子密度優(yōu)化以及原子模型的構(gòu)建[16-18]。對于生物大分子，一般情況下難以直接從衍射數(shù)據(jù)求得相位。結(jié)構(gòu)解析中解決相位問題的一般方法有分子置換法，同晶置換法和反常散射法[19-20]。分子置換法需要同源性較高的同源結(jié)構(gòu)來解析相位，而Ⅱ型限制酶同源性較低，無法利用分子置換法解析Bsa I 的相位問題。同晶置換法需要首先獲得大量蛋白晶體進行重金屬浸泡，因此本實驗嘗試在重組蛋白表達時制備硒代蛋白衍生物，利用反常散射法推算晶體相位[21-22]。

本研究以pBAD 質(zhì)粒為載體，利用大腸桿菌ER2566（E.coli.）為宿主菌，制備ⅡS 型限制性內(nèi)切酶Bsa I 及其硒代蛋白衍生物，利用坐滴法進行初步的晶體生長研究，為后續(xù)闡明Bsa I 的三維結(jié)構(gòu)及作用機理提供實驗基礎(chǔ)，進而為其定向改造和功能優(yōu)化提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

感受態(tài)菌株B834（DE3）、ER2566 武漢淼靈生物科技有限公司；λDNA 莫納（武漢）生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨 Thermo Fisher Scientific 公司；Ni 親和層析填料、UniGel-80Q 陰離子層析填料 江蘇納微生物科技有限公司；其余化學試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方 LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 5.0，胰蛋白胨10.0，氯化鈉 10.0；M9 培養(yǎng)基（g/L）：十二水合磷酸氫二鈉 17.09，磷酸二氫鉀 3.0，葡萄糖 4.0，硫酸鎂0.24，氯化鈉 0.5，氯化鈣 0.011，氯化銨 1.0。

凝膠成像系統(tǒng) 上海勤翔科學儀器有限公司；超高壓連續(xù)流細胞破碎儀 廣州聚能生物科技有限公司；AKTATm Pure 蛋白純化儀 GE 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的獲取 將編碼Ⅱ型限制酶Bsa I序列（Q6SPF4）及甲基化酶 Bsa I-M 基因序列（Q6SPF6）經(jīng)人工合成構(gòu)建在pBAD 載體上（安徽通用生物公司）。將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入到ER2566感受態(tài)細胞內(nèi)（冰浴30 min，42 ℃熱激1 min，冰浴5 min，加入500 μL 無抗LB，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)1 h），將培養(yǎng)液在固體平板劃線，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，獲得重組菌株[23]。

1.2.2 重組Bsa I 蛋白的表達與純化 將重組菌株ER2566-Bsa I 在含有氨芐霉素的LB 平板上劃線稀釋，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取數(shù)個單克隆在含有氨芐霉素的LB 液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0。進行小量誘導實驗（實驗組1），取活化液10 mL，加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h 后，收集菌體，加水溶解，100 ℃煮沸15 min，取上清，SDS-PAGE 點膠驗證蛋白表達情況，通過實驗組1 確定蛋白表達后進行大量誘導實驗（實驗組2）。按1:50 比例在500 mL LB 培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，其OD600值為0.6～0.8 時加入20% L-ara，在37 ℃下進行誘導5 h 后，收集發(fā)酵菌體。發(fā)酵菌體重懸至裂解液（25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl），用細胞破碎儀1000 bar 破碎至菌液澄清透亮，4 ℃下13000 r/min 離心1 h，收集上清；然后將上清液與鎳填料結(jié)合過夜；利用15 mmol/L 低濃度咪唑洗雜蛋白，再利用250 mmol/L 高濃度咪唑洗脫目的蛋白；目的蛋白洗脫液用UniGel-80Q 陰離子層析柱進行下一步純化，低鹽溶液（25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）進行柱平衡，鹽濃度梯度洗脫目的蛋白。蛋白濃度的確定：通過測量樣品在280 nm 處的吸光度。

1.2.3 Se-Bsa I 蛋白的表達與純化 活化方法見1.2.2，首先進行小量誘導實驗（實驗組1），取活化液200 μL 加入10 mL 過度培養(yǎng)基中（LB 培養(yǎng)基：M9培養(yǎng)基體積比為1:4），37 ℃ 200 r/min 搖床培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0，2500×g 離心5 min 后，收集菌體，置換到M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h，分2 次加入硒代甲硫氨酸，誘導開始時及誘導2 h 后各添加一次硒代甲硫氨酸，每次加入量為0.25 mg，誘導完成后，收集菌體，加水溶解，100 ℃煮沸15 min，取上清，SDS-PAGE 點膠驗證蛋白表達情況。

通過實驗組1 確定蛋白表達后進行大量誘導實驗（實驗組2）。按照1:50 比例將活化液接種于500 mL 過渡培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)（實驗組2），待其OD600值為0.6～0.8 時，將菌體置換到完全M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h。加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h，分2 次加入硒代甲硫氨酸，誘導開始時及誘導2 h 后各添加一次硒代甲硫氨酸，每次加入量為0.0125 g，使其終濃度為0.05 g/L。誘導完成后，收集菌體，硒代蛋白純化過程與重組蛋白一致，見方法1.2.2。

1.2.4 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白的質(zhì)譜檢測 為驗證 Se-Bsa I 蛋白中硫原子被硒原子的取代情況，采用AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀對 Bsa I 重組蛋白和其硒代蛋白進行分析鑒定，質(zhì)譜檢測在華中科技大學完成。

1.2.5 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白圓二色譜檢測 為初步檢驗重組Bsa I 蛋白與Se-Bsa I 蛋白二級結(jié)構(gòu)的區(qū)別，將重組蛋白和硒代蛋白稀釋至0.5 mg/mL，并使用圓二色譜儀對其進行掃描，樣品池光程為0.5 mm，近紫外區(qū)波長范圍為190～240 nm，分析其二級結(jié)構(gòu)有無差異。

1.2.6 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白酶活檢測重組Bsa I 蛋白（1 mg/mL）或Se-Bsa I 蛋白（1 mg/mL）各1 μL，底物為1 μg 的λDNA，配制成20 μL 的反應(yīng)體系，在37 ℃的條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后高溫失活。使用1 %瓊脂糖凝膠電泳，鑒定Bsa I 蛋白或Se-Bsa I 蛋白對λDNA 切割條帶。

1.2.7 重組Bsa I 蛋白結(jié)晶條件初篩 將蛋白濃縮到10 mg/mL，通過氣相擴散坐滴法對9 種結(jié)晶試劑盒（Crystal Screen Cryo-HR2-112、PEGRx 1 -HR2-082、Index-HR2-144、Crystal Screen Lite-HR2-128、Crystal Screen Cryo -HR2-122、SaltRx 1 -HR2-107、Crystal Screen-HR2-110、Natrix-HR2-116、PEGRx 2-HR2-084）條件進行蛋白晶體生長條件的初步探索。使用NT8 機械手臂將蛋白溶液和生長池液按照1:1 的比例混合，點樣至晶體板的樣品槽內(nèi)，并使用透明塑封紙封裝。放入全自動晶體生長觀察成像分析儀，設(shè)置溫度為20 ℃，間隔12 h 拍照，觀察晶體在不同條件下的生長情況。蛋白在2 種情況下生長出晶體，條件a：0.2 mol/L 醋酸鎂四水合物，0.1 mol/L二甲胂酸鈉三水合物 pH6.5，20%聚乙二醇8000；條件b：0.1 mol/L 三水醋酸鈉 pH4.6，2.0 mol/L 硫酸銨。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達載體的構(gòu)建

利用原核生物表達體系表達內(nèi)切酶，首先要考慮的問題是避免重組內(nèi)切酶對宿主DNA 的切割傷害。為解決這個難題，本研究在載體pBAD 上同時構(gòu)建了Bsa I 基因和Bsa I 的甲基化酶基因。如圖1所示，在Bsa I 基因和Bsa I-M 基因的上下游分別構(gòu)建了啟動子和終止子，使兩個蛋白分別表達。另外，在Bsa I 基因的上游加入6×His 標簽序列，使目的蛋白Bsa I 可以帶有融合標簽6×His。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過熱激化法轉(zhuǎn)化到ER2566 感受態(tài)細胞中，獲得Bsa I 重組蛋白的表達菌株。

圖1 pBAD-Bsa I 質(zhì)粒圖譜Fig.1 Schematic of pBAD-Bsa I construct

2.2 Bsa I 重組蛋白的表達和純化

首先將構(gòu)建成功的Bsa I 重組表達菌株ER2566進行誘導實驗，以確定目的蛋白表達情況。限制性內(nèi)切酶Bsa I 重組蛋白的分子質(zhì)量約為65 kDa。將表達菌株在37 ℃下誘導5 h，小量實驗驗證（實驗組1）泳道2 比泳道1 多了一條誘導后條帶。與預(yù)期65 kDa 大小相仿，證明重組Bsa I 蛋白在ER2566 菌株中有誘導表達。然后進行大規(guī)模發(fā)酵實驗（實驗組2），將誘導后的發(fā)酵液進行超高壓破碎，如圖2a泳道3，在目的蛋白與鎳基至結(jié)合后，利用高濃度咪唑洗脫，如圖2a泳道4 所示，經(jīng)過Ni 親和層析后重組Bsa I 蛋白的純度明顯提升。但重組Bsa I 蛋白的純度還未達到蛋白晶體生長所需的純度，因此對重組Bsa I 蛋白利用陰離子交換層析進一步純化，如圖2c 所示，蛋白純度可以達到90%以上。最終，每升發(fā)酵液得到了6.6 mg 的目的蛋白。

圖2 重組蛋白Bsa I 的表達與純化Fig.2 Expression and purification of Bsa I

2.3 Se-Bsa I 硒代蛋白的表達與純化

實驗室最常用的方法是使用甲氨酸缺陷型菌株制備硒代蛋白，利用M9 培養(yǎng)基發(fā)酵獲得硒代蛋白，其中大腸桿菌常用甲硫氨酸缺陷型菌株是B834[24]。因此，本研究將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導入B834（DE3）菌株中，并進行目的蛋白的小量表達試驗。經(jīng)過SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)沒有硒代蛋白的目的條帶。推測其結(jié)果可能是甲硫氨酸缺陷型菌株B834（DE3）不適合同時誘導表達Bsa I 基因和Bsa I-M 基因，B834 菌株中的甲基化修飾系統(tǒng)阻礙了表達Bsa I 的甲基化酶，而無法獲得目的蛋白Bsa I。程藝等[25]在表達重組Se-Nco I 時，利用甲硫氨酸缺陷型菌株B834時蛋白未表達，之后利用表達重組Nco I 的BL21（DE3）pLysS 菌株和M9 培養(yǎng)基成功表達出硒代蛋白。

因此，本實驗采用原ER2566 表達菌株，利用M9 培養(yǎng)基來替換甲硫氨酸為硒代甲硫氨酸，進行Se-Bsa I 蛋白的誘導表達，誘導后的重組Bsa I 蛋白在硒代培養(yǎng)基中有誘導條帶產(chǎn)生，表明此方法是可行的。但是誘導后的菌體量少，無法獲得足夠的硒代蛋白。推測是由于硒代甲硫氨酸的細胞毒性[26]以及M9 培養(yǎng)基不是大腸桿菌的最適培養(yǎng)基，會嚴重影響菌體的生長，從而降低Se-Bsa I 重組蛋白的表達量。因此，本實驗通過分批次加入硒代甲硫氨酸，減少硒代甲硫氨酸的濃度，從而降低硒代甲硫氨酸的細胞毒性。通過小量實驗（實驗組1）表明分批次加入可以提高誘導后菌體量，從而提高硒代蛋白的產(chǎn)量。大規(guī)模發(fā)酵（實驗組2）經(jīng)過Ni 親和層析和陰離子交換層析的純化，如圖3a 泳道4 和圖3c 所示。最終，每升發(fā)酵產(chǎn)物得到4 mg 目的蛋白。

圖3 重組蛋白Se-Bsa I 的表達與純化Fig.3 Expression and purification of Se-Bsa I

邵鈺晨等[27]在制備硒代蛋白時也發(fā)現(xiàn)了此類問題，指出M9 培養(yǎng)基對于LB 培養(yǎng)基來說，營養(yǎng)成分相對貧瘠，因此邵鈺晨等在培養(yǎng)過程中添加異亮氨酸等多種氨基酸，抑制大腸桿菌本底代謝，從而提高外源硒代甲硫氨酸利用率，提高硒代蛋白表達量。通過這些改進最終獲得了濃度為10 mg/mL、純度在95%以上的Se-Mlu I 蛋白。后續(xù)實驗將針對硒代蛋白誘導條件進行優(yōu)化，以達到滿足晶體生長的蛋白濃度。

SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示Se-Bsa I 硒代蛋白的大小和Bsa I 蛋白大小類似，但電泳圖中很難判斷Se-Bsa I 蛋白是否被硒代，因此后續(xù)進行質(zhì)譜檢測Se-Bsa I 蛋白的分子量與Bsa I 蛋白的區(qū)別，從而判斷Se-Bsa I 蛋白中甲硫氨酸的硒代概率。

2.4 重組蛋白Bsa I 和Se-Bsa I 的質(zhì)譜檢測

由于采用原ER2566 表達菌株，利用M9 培養(yǎng)基摻入硒代甲硫氨酸來替換目的蛋白中的甲硫氨酸，存在替換不完全的風險。為了檢測Se-Bsa I 蛋白中硒原子的取代率，將純化得到的Bsa I 和Se-Bsa I 取樣進行質(zhì)譜檢測如圖4 所示。經(jīng)過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，重組Bsa I 蛋白的分子質(zhì)量為65278.87 Da，這與Bsa I 理論相對分子質(zhì)量65 kDa 相符。而重組Se-Bsa I 蛋白相對分子質(zhì)量為65758.26 Da，與Bsa I 重組蛋白之間相差479.39 Da。已知硫元素相對分子質(zhì)量為32.065 Da，硒元素的相對分子質(zhì)量為78.96 Da，因此平均每分子Se-Bsa I 中被硒原子取代的硫原子數(shù)量為479.39/（78.96-32.065）=10.22。通過分析重組Bsa I 蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其有11 個甲硫氨酸，存在11 個硫原子。因此，推測出本批次的Se-Bsa I 蛋白質(zhì)中甲硫氨酸被硒代甲硫氨酸取代的概率約92.91%，樣品適合進行后續(xù)X-射線衍射實驗[28]。

圖4 Bsa I 和Se-Bsa I 質(zhì)譜圖Fig.4 Serum mass spectrometry of Bsa I and Se-Bsa I

2.5 重組蛋白Bsa I 和Se-Bsa I 的圓二色譜圖檢測

為了解析限制性內(nèi)切酶Bsa I 的三維結(jié)構(gòu)，Se-Bsa I 重組蛋白樣品與Bsa I 重組蛋白樣品的結(jié)構(gòu)必須高度相似。測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最常用的方法是圓二色譜法，其廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中[29]。為了進一步明確硒代蛋白對重組蛋白的結(jié)構(gòu)有無影響，本研究將重組蛋白樣品Bsa I 和 Se-Bsa I 進行圓二色譜檢測，解析其二級結(jié)構(gòu)（圖5）。CD 圖譜均顯示在192 nm 處有一個正峰，208、222 nm 處有兩個負峰，這表明Bsa I 和Se-Bsa I 都是以α-螺旋的形式存在，說明蛋白折疊正確，構(gòu)象穩(wěn)定。結(jié)果表明，Bsa I 和Se-Bsa I 在二級結(jié)構(gòu)上無差異，硒代不影響其結(jié)構(gòu)。為后續(xù)功能以及結(jié)構(gòu)研究奠定了很好的基礎(chǔ)。

圖5 Bsa I 和Se-Bsa I 圓二色譜圖Fig.5 Circular dichromatogram of Bsa I and Se-Bsa I

2.6 蛋白及其硒代蛋白的酶活檢測

本研究分別對Bsa I 重組蛋白與Se-Bsa I 重組蛋白進行酶活力檢測，進一步檢測硒代是否影響野生型蛋白的生物學功能。取1 μg Bsa I 和1 μg Se-Bsa I 蛋白，對1 μgλDNA 進行30 min 快速酶切實驗，結(jié)果見圖6。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，Bsa I 和Se-Bsa I 都有明顯的特征酶切條帶，與Thermo Fisher公司網(wǎng)址中公布的Bsa I 特征酶切條帶相似。酶切結(jié)果表明了Se-Bsa I 蛋白與野生型蛋白具有相似的生物學活性，即硒代蛋白活性并未受到硒代影響。

圖6 Bsa I 和Se-Bsa I 的酶活驗證Fig.6 Enzymes activity of Bsa I and Se-Bsa I

2.7 Bsa I 蛋白結(jié)晶生長條件篩選

本實驗將重組后的Bsa I 蛋白利用坐滴法進行蛋白質(zhì)晶體的初篩。初篩使用購自Hampton Research公司的商品化蛋白質(zhì)晶體篩選試劑盒，蛋白質(zhì)液滴與點晶體等體積混合后，于20 ℃的全自動晶體生長觀察成像分析儀中進行晶體培養(yǎng)，每隔12 h 自動拍照采集數(shù)據(jù)[30-31]。在使用商品化蛋白結(jié)晶試劑盒進行蛋白結(jié)晶，最初得到的蛋白結(jié)晶條件往往不是最優(yōu)條件，大概率會出現(xiàn)晶體過小，分辨率較差，衍射能力較低等情況[32-33]。篩選結(jié)果顯示有2 個條件生長晶體，晶體如圖7 所示。

圖7 Bsa I 的結(jié)晶條件篩選Fig.7 Screening of crystallization conditions of Bsa I

蛋白晶體可以在a 條件下（0.2 mol/L 醋酸鎂四水合物，0.1 mol/L 二甲胂酸鈉三水合物 pH6.5，20%聚乙二醇8000）生長出較小的顆粒狀結(jié)晶，并且可以在b 條件（0.1 mol/L 三水醋酸鈉pH4.6，2 mol/L硫酸銨）下生長出不規(guī)則的球形晶體，但初步結(jié)晶條件所篩選到的蛋白結(jié)晶較為脆弱且邊緣不規(guī)則，無法撈出進行衍射實驗。針對這種情況，程焯等[34]在制備LxmX 蛋白時，通過利用最初篩選得到的晶體生長條件，設(shè)計正交試驗，成功得到了邊緣整齊，可用于衍射數(shù)據(jù)收集的LxmX 蛋白及硒代LxmX 蛋白晶體。因此后續(xù)實驗將對初步得到的蛋白結(jié)晶條件進行優(yōu)化，以獲得高分辨率的晶體。此外，通過觀察所有晶體的生長情況，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白都發(fā)生了沉淀，推測Bsa I 的穩(wěn)定性可能是影響其蛋白晶體生長的一個關(guān)鍵因素[35-37]。

3 結(jié)論

限制性內(nèi)切酶是分子生物學最常用的工具之一，而內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)決定其功能。但大部分內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)沒有被解析，這限制了內(nèi)切酶的發(fā)展。通過制備硒代衍生物進行衍射解析結(jié)構(gòu)，其操作更為簡單，適用性更高。但在制備硒代蛋白過程中，B834 甲硫氨酸缺陷型菌株往往易受到外源基因的影響，無法獲得重組蛋白，具有局限性，同時硒代甲硫氨酸的毒性問題以及發(fā)酵條件鮮有報道，這也限制了制備硒代蛋白的成功率。本實驗利用限制性內(nèi)切酶Bsa I 和甲基化酶Bsa I-M 的大腸桿菌共表達系統(tǒng)，獲得大量表達的Bsa I 蛋白，通過M9 培養(yǎng)基添加硒代甲硫氨酸的方式，獲得了大小、性質(zhì)和重組蛋白一致的硒代蛋白，并在兩種結(jié)晶條件下培養(yǎng)出蛋白晶體，為后續(xù)Bsa I 蛋白的晶體衍射，解析其三維結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。