梁雪蓮 廖潔 蔣文艷 陳偉 王海軍 莫磊興 肖燕艷妮 王天順

摘 要：甘蔗在運輸和貯存期間極易受病原菌侵染，發(fā)生變質并產生毒素，其中甘蔗受梨孢假殼感染及產生3-硝基丙酸（3-NPA）毒素是引起食用變質甘蔗中毒的主要原因。文章通過綜述甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的鑒定、產毒條件、環(huán)境影響因素及其3-NPA毒素合成機理、檢測方法等研究進展，發(fā)現(xiàn)目前尚缺乏對甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的全面、系統(tǒng)認識，也未對其產毒能力、產毒機理及毒性快速監(jiān)測方法等提出明確要求和出臺相關規(guī)定，關于甘蔗采后霉變的防控技術也鮮見報道。因此，今后應在以下幾方面開展相關研究：（1）系統(tǒng)開展甘蔗梨孢假殼產毒能力評價、菌株分類及快速鑒定方法等研究，對高毒菌株所屬區(qū)域的甘蔗消費市場進行重點監(jiān)控，為疑似感染高毒菌株的甘蔗預警提供科學依據(jù)和技術支撐；（2）在侵染甘蔗條件下，深入研究環(huán)境因素對梨孢假殼毒素3-NPA產生和積累規(guī)律的影響；（3）探究毒素合成途徑及分子調控機理，闡明梨孢假殼毒素3-NPA的代謝過程，解析生物合成3-NPA的系統(tǒng)理論知識；（4）利用分子生物學手段開展3-NPA檢測研究，提高檢測方法的準確性、靈敏度等；（5）通過生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假殼感染及其毒素3-NPA的合成，研制篩選出高效、安全、適用的甘蔗防霉變藥劑。

關鍵詞：甘蔗；霉變；梨孢假殼（節(jié)菱孢）；3-硝基丙酸（3-NPA）

中圖分類號：S566.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ?文章編號：2095-820X（2023）02-0028-04

0 引言

鮮食甘蔗具有豐富的營養(yǎng)，且富含葡萄糖、蔗糖和果糖等易吸收的糖類（含糖量約12%），以及人體必需的多種維生素、氨基酸和微量元素，尤其是鐵含量高達9 mg/kg，因此又被稱為補血果［1］。中醫(yī)認為甘蔗入肺、胃二經，具有潤燥、補肺益胃、清熱、生津、下氣等功效。甘蔗因其口感甜蜜、營養(yǎng)豐富，且具有補益身體之功效，而深受消費者喜愛［2］。目前，我國甘蔗種植區(qū)域已由過去的江南8?。▍^(qū)）擴延到22?。ㄊ?、區(qū)）（不包括臺、港、澳），全國蔗地總面積約27.0萬ha，年總產量超過2000萬t，產值超過200億元人民幣。我國的甘蔗種植主要集中在廣西、廣東、福建、云南、海南、四川、江西等南方地區(qū)，僅廣西甘蔗種植面積就超過2.7萬ha，約占全國種植面積的10%，居全國首位。每年元旦前后至春節(jié)前后為甘蔗的集中采收季節(jié)，大量甘蔗運往我國北方地區(qū)的消費市場，但甘蔗在運輸和貯存期間極易受病原菌侵染，發(fā)生變質，并產生微生物毒素。自1972年我國首次發(fā)生變質甘蔗引起中毒病例以來［3］，幾乎每年都有因食用變質甘蔗而引起中毒的病例發(fā)生。為此，文章通過綜述甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的鑒定、產毒條件、環(huán)境影響因素及其毒素3-硝基丙酸（3-nitropropionic acid，3-NPA）合成機理、檢測方法等研究進展，以期為甘蔗生產、儲運保鮮、食用安全預防及相關科學研究提供參考。

1 甘蔗霉變病原菌梨孢假殼（節(jié)菱孢）

1.1 梨孢假殼（節(jié)菱孢）鑒定研究進展

節(jié)菱孢（Arthrinium）在自然界廣泛分布，常寄生或腐生于長有植被的土壤和一些經濟作物的根部、莖部及葉片上［4］。節(jié)菱孢系Kunze于1817年命名［5］，根據(jù)菌株的生長特性、分生孢子形態(tài)，將其歸類于半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）暗色孢科（Sematiaceae）［6］。劉興玠等［7］從中毒甘蔗和變質甘蔗樣品中分離獲得產毒的節(jié)菱孢，根據(jù)菌落形態(tài)特征、生長速度、分生孢子著生狀態(tài)、孢子形態(tài)等形態(tài)學進行分類鑒定，最終分為甘蔗節(jié)菱孢（A. sacchari M. B. Ellis）、蔗生節(jié)菱孢（A. saccharicolz Stevenson）和暗孢節(jié)菱孢［A. phacospermum （Corda） M. B. Ellis］。Pintos和Alvardo［8］將從變質甘蔗中分離獲得的甘蔗節(jié)菱孢、蔗生節(jié)菱孢、暗孢節(jié)菱孢等55種節(jié)菱孢重新劃分為梨孢假殼屬（Apiospora）。廣西農業(yè)科學院農產品質量安全與檢測技術研究所農產品質量安全風險評估課題組從霉變甘蔗中分離出能產生3-NPA的另一種梨孢假殼，經形態(tài)及內轉錄間隔區(qū)（ITS）標記技術鑒定，確定為蘆竹梨孢假殼（A. arundinis）［9］。這是首次采用分子鑒定梨孢假殼，且對篩選出來的蘆竹梨孢假殼進行產毒能力鑒定，結果發(fā)現(xiàn)不同菌株間存在明顯差異。

劉興玠等［10］從引起中毒重癥的甘蔗中分離獲得的優(yōu)勢菌均為節(jié)菱孢，其占比為58.7%～65.6%，而中毒甘蔗樣品中的節(jié)菱孢檢出率達32.0%。甄應中等［11］從變質甘蔗中分離獲得的串珠鐮刀菌均不產毒，而產毒的節(jié)菱孢比例高達48.8%。胡文娟等［12］證實節(jié)菱孢產生的毒素為耐熱的3-NPA，主要損害神經中樞，對人類及動物均有強烈的毒性作用。侯正宗等［13］對中毒死亡患者食用剩下的同節(jié)甘蔗及同批庫存、市售甘蔗進行真菌分離，結果顯示節(jié)菱孢的檢出率分別為70.0%、57.1%和43.5%。劉興玠等［14］通過采集自然環(huán)境中的樹皮、秸稈、草類及土壤等樣品進行分析，結果發(fā)現(xiàn)只在長期貯存過甘蔗的倉庫土壤中分離出節(jié)菱孢，說明節(jié)菱孢極少腐生于一般土壤及其他植物；此外，測定發(fā)現(xiàn)米曲霉（Aspergillus oryzae）、黃曲霉（A. flavus）和醬油曲霉（A. sojae）等57株霉菌均不產生3-NPA，故推測節(jié)菱孢是變質甘蔗中毒的唯一病原菌。已有研究證實，誤食含高濃度3-NPA的變質甘蔗可導致嚴重的食物中毒，臨床上一般在食用變質甘蔗后2～5 h出現(xiàn)中毒癥狀，輕者伴有惡心、嘔吐、腹痛、瀉肚等消化道癥狀，部分患者出現(xiàn)暈厥、視物不清晰、不能站立；重癥者則手腳顫抖，陣發(fā)性強直抽搐，甚至出現(xiàn)昏迷［15］。

1.2 環(huán)境因素對梨孢假殼（節(jié)菱孢）的影響

劉江等［16］分別從菌株、培養(yǎng)基、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等方面探討環(huán)境因素對節(jié)菱孢產毒的影響，結果表明影響節(jié)菱孢產毒的因素排序為菌株>溫度>時間>培養(yǎng)基>pH；其中，以麥芽汁—酵母膏為培養(yǎng)基、20 ℃下培養(yǎng)21 d、pH 4.5時的3-NPA產量最高，是節(jié)菱孢在實驗條件下的最佳產毒因子。目前，尚缺乏在侵染甘蔗條件下環(huán)境因素對梨孢假殼毒素產生和積累規(guī)律等方面的相關研究。劉江等［16］對甘蔗霉變過程中各環(huán)節(jié)進行調查研究，發(fā)現(xiàn)影響甘蔗霉變的關鍵因素是貯存條件和貯存時間，因此今后應重點關注對影響節(jié)菱孢繁殖及產毒因素的研究，為預防食用甘蔗中毒提供參考依據(jù) 。劉興玠等［14］研究證實，節(jié)菱孢在適宜的基質中、15～28 ℃下能產生大量的3-NPA毒素，且毒素含量隨貯存時間的延長而增加?？梢?，貯存期控制甘蔗霉變是預防果蔗中毒的關鍵所在，但目前關于甘蔗采霉變防控技術及防霉變殺菌藥劑的研究鮮見報道。

2 3-NPA毒素的研究進展

2.1 3-NPA合成機理研究

3-NPA為結構簡單的小分子生物毒素，其不僅來源于霉變甘蔗，一些真菌和高等植物也具有合成3-NPA毒素的能力。目前，已知能合成3-NPA的真菌有黃曲霉、米曲霉、深酒色青霉（Penicillium atrovenetum）、鏈絲菌（Streptomyces sp.）、節(jié)菱孢、放線菌（Actinomycete）和絲狀菌（Filamentousfungus）等；此外，金虎尾科（Malpighiaceae）、堇菜科（Violaceae）、豆科（Leguminosae）等高等植物同樣具有合成3-NPA毒素的能力［17］。產毒素真菌只能合成游離態(tài)的3-NPA毒素，無法合成3-NPA的葡萄糖酯類衍生物，而高等植物能合成3-NPA的葡萄糖酯類衍生物［17］。能合成3-NPA毒素的真菌大部分能使3-NPA毒素降解成硝酸鹽或亞硝酸鹽，故推測3-NPA毒素可能是天門冬氨酸降解生成硝酸鹽途徑的一個關鍵中間物質：天門冬氨酸→β-氨基丙酸→3-NPA→亞硝酸鹽→硝酸鹽［17］。Birch等［18］、Birkingshaw和Dryland［19］采用同位素14C標記研究深酒色青霉的3-NPA毒素合成機理，結果發(fā)現(xiàn)β-氨基丙酸并不參與3-NPA的合成，是由天門冬氨酸通過氨基氧化及失去C1而形成。Shaw［20］研究表明，深酒色青霉粗提液可催化β-硝基丙烯酸還原成3-NPA，催化這一反應的酶即為β-硝基丙烯酸還原酶。但至今關于梨孢假殼產毒能力穩(wěn)定性及3-NPA毒素的合成、降解途徑和分子調控機理尚無文獻報道。

2.2 3-NPA檢測方法

甘蔗3-NPA毒素含量檢測對其食用安全保障具有重要的現(xiàn)實意義。早期檢測3-NPA毒素主要采用薄層色譜法［21，22］，國家標準檢測法BJS 202205《甘蔗及甘蔗汁中3-NPA的測定》規(guī)定采用高效液相色譜檢測3-NPA［23］，且要求樣品的檢出限和定量限分別為0.3和1.0 mg/kg。隨著儀器設備的發(fā)展革新，汪儆等［24］利用氣質色譜—質譜法對豆科中的3-NPA毒素進行定性和定量檢測；劉勇等［25］利用熱能檢定器—氣相色譜對大鼠血清中的3-NPA毒素含量進行檢測，其靈敏度可達4 ng/mL；邵國健等［26，27］利用固相萃取—離子色譜法、免試劑離子色譜法檢測甘蔗中的3-NPA毒素，發(fā)現(xiàn)在0.1～50.0 μg/mL范圍內線性關系良好，加標回收率為89.2%～102.0%，檢出限為0.03 mg/kg；解娜等［28］采用二極管陣列與毛細管電泳結合檢測甘蔗中的3-NPA毒素，發(fā)現(xiàn)在1.0～100.0 mg/L范圍內線性關系良好，加標回收率為95.2%～103.9%，檢出限為0.3 mg/L。Jiang等 ［29］采用乙酰膽堿酯酶電化學生物傳感器檢測3-NPA，其抑制率和3-NPA含量的對數(shù)在0.10～30.00 μg/L范圍內線性關系良好，方法穩(wěn)定、靈敏，檢測限為0.05 μg/L，甘蔗樣品中3-NPA加標回收率達88.8%～98.2%，其靈敏度遠高于國家標準檢測法BJS 202205。目前，3-NPA毒素檢測最常用的方法是液相色譜法和液相色譜—質譜聯(lián)用，其準確度和靈敏度均較高，但也存在成本高、專業(yè)要求高、耗時長等弊端；熒光法和電化學法在成本、檢測速度等上具有優(yōu)勢，但其靈敏度、選擇性等需進一步優(yōu)化。

3 展望

盡管國內外已開展了大量關于甘蔗霉變病原菌梨孢假殼及其毒素的研究工作，但主要集中在梨孢假殼及3-NPA毒素的分離鑒定方面，尚缺乏對甘蔗霉變病原菌梨孢假殼的全面、系統(tǒng)認識，也未對甘蔗霉變病原菌的產毒能力、產毒機理及毒性快速監(jiān)測方法等提出明確要求和出臺相關規(guī)定，關于甘蔗采后霉變的防控技術也鮮見報道，以至于難以對甘蔗采后儲運過程的食用安全性進行全面系統(tǒng)地風險評估，更無法針對性提出有效的甘蔗霉變病原菌防控措施。因此，今后應在以下幾方面開展相關研究：（1）系統(tǒng)開展甘蔗梨孢假殼產毒能力評價、菌株分類及快速鑒定方法等研究，對高毒菌株所屬區(qū)域的甘蔗消費市場進行重點監(jiān)控，為疑似感染高毒菌株的甘蔗預警提供科學依據(jù)和技術支撐；（2）在侵染甘蔗條件下，深入研究環(huán)境因素對梨孢假殼毒素3-NPA產生和積累規(guī)律的影響；（3）探究毒素合成途徑及分子調控機理，闡明梨孢假殼毒素3-NPA的代謝過程，解析生物合成3-NPA的系統(tǒng)理論知識；（4）利用分子生物學手段開展3-NPA檢測研究，提高檢測方法的準確性、靈敏度等；（5）通過生物防控方法高效防控甘蔗中梨孢假殼感染及其毒素3-NPA的合成，研制篩選出高效、安全、適用的甘蔗防霉變藥劑。

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