曹瑩

摘 要：本研究以菠菜（Spinacia oleracea L.）根尖分生組織為材料，采用羥基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）結(jié)合的雙阻斷法對菠菜根尖細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)合顯微鏡觀察和統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果，對有絲分裂中期同步化誘導(dǎo)作了探討，并對中期染色體分離也作了初步研究。在試驗中分別設(shè)置了羥基脲（HU）和甲基胺草磷（APM）的不同濃度梯度，并對甲基胺草磷（APM）設(shè)置了作用時間梯度，以研究其最佳同步化誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明，經(jīng)1.25 mmol/L HU、10 μmol/L APM處理菠菜根尖細(xì)胞，能夠使細(xì)胞有絲分裂中期指數(shù)（Met．I）達(dá)40％。

關(guān)鍵詞：同步化；中期指數(shù)；羥基脲；甲基胺草磷；菠菜

文章編號：1005-2690（2023）18-0001-03? ? ? ?中國圖書分類號：S636.1? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

植物細(xì)胞的同步化誘導(dǎo)是指細(xì)胞分裂周期受到低溫或藥物處理的干擾，使大多數(shù)細(xì)胞停留在同一分裂階段（通常是中期）[1]。人工誘導(dǎo)同步化主要有2種方法。一是DNA合成阻斷法。采用一定量的低毒或無毒的特異性DNA合成抑制劑（通常是TdR或羥基脲）加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時間（TG2+TM+TG1）后，使細(xì)胞停留于S期，且不影響處于其他時相的細(xì)胞進(jìn)行周期的運轉(zhuǎn)。抑制劑去除后，細(xì)胞就可進(jìn)行同步化運轉(zhuǎn)[2]。二是分裂中期阻斷法。細(xì)胞分裂中期，大量微管參與形成細(xì)胞分裂器——紡錘體，從而保證細(xì)胞分裂過程的完成。此時以藥物抑制微管形成紡錘體，則可以將運轉(zhuǎn)中的細(xì)胞阻斷于分裂中期。

高等植物細(xì)胞有絲分裂同步化誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞群體中，獲得大量分裂時期一致的細(xì)胞，便于后續(xù)對細(xì)胞周期調(diào)控、染色體形態(tài)分析、染色體顯微解剖和性別決定機(jī)制的研究。由于植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，早期以懸浮細(xì)胞系為材料，誘導(dǎo)植物細(xì)胞有絲分裂過程中的中期染色體分離同步化的研究進(jìn)展十分緩慢。目前，對春小麥、鳳仙、大麥和蠶豆根尖分生組織細(xì)胞同步化誘導(dǎo)的研究已被證明是有效的[3-6]，利用玉米細(xì)胞系的有絲分裂同步誘導(dǎo)和染色體分離方法也顯示有效[7]。

本研究中所采用的植物材料——菠菜，又名波斯菜、赤根菜等，為藜科菠菜屬1年生或2年生草本植物，四季均可播種，以春播和秋播為主，生長期約為60 d。菠菜原產(chǎn)于波斯（現(xiàn)伊朗），唐代傳入我國，栽培歷史悠久。菠菜主根發(fā)達(dá)，肉質(zhì)根紅色，味甜可食。菠菜是研究雌雄異株的模式植物之一，研究主要集中于細(xì)胞學(xué)、生理生化和分子標(biāo)記上。菠菜處于性染色體演化的第2階段，具有絕對雄株、營養(yǎng)雄株、絕對雌株、雌雄同株、雄全同株、雌全同株和三性同株等多種不同的性別表現(xiàn)類型[8-9]。本研究所進(jìn)行的同步化誘導(dǎo)研究，可以從形態(tài)學(xué)上將不同性別表現(xiàn)類型的菠菜進(jìn)行染色體對比，為后續(xù)菠菜性別分化的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

本試驗以菠菜根尖為材料，采用羥基脲和甲基胺草磷雙阻斷法處理菠菜根尖，對菠菜根尖分生組織進(jìn)行有絲分裂中期高頻同步化誘導(dǎo)實驗，以準(zhǔn)確識別菠菜體細(xì)胞中染色體的形態(tài)、數(shù)量和分布，為后續(xù)染色體分析、性別決定分析和性別決定基因研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 植物材料

菠菜種子購自種子公司。

1.1.2 試驗試劑

羥基脲溶液：用蒸餾水稀釋到不同濃度，分別是1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L。

甲基胺草磷溶液：用蒸餾水稀釋到不同濃度，分別是2.5、5.0、10.0 μmol/L。

卡諾氏固定液：無水乙醇和冰乙酸以3∶1比例配制。

1 mol/L HCl：37％濃鹽酸82.5 mL（比例是1.19 g/mL）用蒸餾水定容至1 000 mL。

酸解液：HCl 1mol/L與45％乙酸以3∶1比例配制。

羥基脲：粉末于18～25 ℃條件下保存，遇熱易分解，使用時配母液于4 ℃保存，保存時間不宜超過15 d。

甲基胺草磷：試劑有一定毒性，且溶解性較小，配制試劑時應(yīng)注意，可用磁力攪拌器促進(jìn)其溶解。

1.1.3 試驗器材

主要儀器：光學(xué)顯微鏡、磁力攪拌器、LRH-70生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、水浴鍋、低溫冰箱、量筒、燒杯等。

1.2 試驗過程

1.2.1 細(xì)胞有絲分裂中期同步化誘導(dǎo)

浸種：取菠菜種子100～200粒于培養(yǎng)箱23～25 ℃恒溫浸泡菠菜種子24 h，吸水后放于4 ℃冰箱變溫處理24 h。

萌發(fā)：在干凈的培養(yǎng)皿中鋪上2～3層浸透了雙蒸水的濾紙，將處理過的種子均勻分布在培養(yǎng)皿中，然后放入24 ℃的恒溫箱中。

雙阻斷法藥物處理：準(zhǔn)備經(jīng)1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L HU浸泡雙層濾紙培養(yǎng)皿，選取根尖長度約1.5 cm的種子，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中孵育18 h，用雙蒸水沖洗3～4次，再轉(zhuǎn)移到雙蒸水浸泡濾紙培養(yǎng)皿中孵育約3 h，轉(zhuǎn)移至鋪有雙層分別用0.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L APM浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3～6 h，蒸餾水沖洗3次，同步化處理根尖進(jìn)行過夜固定，4 ℃儲存?zhèn)溆肹10-11]。

在試驗中每次改變試劑培養(yǎng)前先用該試劑浸泡種子1 min，培養(yǎng)過程均在黑暗條件下進(jìn)行。

1.2.2 中期分裂相觀察與統(tǒng)計

將固定根尖置于酸解液中（60±1）℃下酸解15～20 min，壓制細(xì)胞后，用改良品紅染色，用光學(xué)顯微鏡觀察，并測定其有絲分裂指數(shù)（Met．I）。制片時，切取每條去除根冠的根1 mm左右，即分生組織所在區(qū)域，進(jìn)行制片（常制1～2張片子，大多數(shù)為1張片子），用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察（詳見圖1）。觀察并統(tǒng)計細(xì)胞（整片）數(shù)時，移動載玻片和鏡頭，同時拍照計數(shù)。

2 試驗結(jié)果

本研究用HU和APM雙阻斷法來誘導(dǎo)菠菜根尖細(xì)胞的有絲分裂中期同步化。在試驗過程中，通過調(diào)整HU、APM的處理濃度、水培和時間等同步化條件，獲得了較高頻率的同步化細(xì)胞。

結(jié)果表明，當(dāng)在23 ℃下用1.25 mmol/L HU處理18 h，室溫下10 μmol/L APM處理4 h，可得到較為理想的結(jié)果，其有絲分裂中期指數(shù)（Met．I）可達(dá)40％（如圖2所示）。

用HU處理分裂期細(xì)胞，可有效阻斷DNA合成過程，在除去HU作用后，又可以迅速恢復(fù)DNA合成過程，以達(dá)到初步同步化的目的[12-13]。同時，由于APM是一種直接與細(xì)胞內(nèi)微管蛋白合成相互作用的特異性藥物，可以成功阻斷中期細(xì)胞紡錘絲的發(fā)育，使有絲分裂過程保持在中期[14]。本研究在利用HU和APM對菠菜根尖分生組織細(xì)胞進(jìn)行雙阻斷后，除少數(shù)處于分裂間期的細(xì)胞外，沒有發(fā)現(xiàn)處于分裂前期、后期或末期的細(xì)胞，表明細(xì)胞的分裂過程已被成功阻斷在分裂中期，有絲分裂正常，染色體無畸變（如圖3和圖4）。由此可知，利用HU-APM雙阻斷法可有效將菠菜根尖分生組織細(xì)胞阻斷在中期[15-16]。

3 討論和結(jié)論

動物能夠相對容易地成功分離和純化中期染色體，而在植物中，由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)堅韌，細(xì)胞很難去體積和溶解，去體積后留下大量細(xì)胞碎片，使染色體的進(jìn)一步純化更加困難，因此進(jìn)展緩慢。HU和秋水仙堿以前被用于誘導(dǎo)植物細(xì)胞有絲分裂同步，但一些研究表明，用于誘導(dǎo)有絲分裂同步的秋水仙堿濃度過高，導(dǎo)致顯著的染色體凝集，從而使染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究變得困難，而且Met．I的比值也偏低。因此，諸多研究者采用APM來替代秋水仙堿。

分裂中期阻斷法的優(yōu)點在于操作簡便、效率高，缺點是藥物毒性較大，如果處理時間過長，獲得的細(xì)胞常常不能恢復(fù)成正常細(xì)胞進(jìn)行周期運轉(zhuǎn)。在同步化誘導(dǎo)的過程中，較有效的做法是幾種方法并用（如低溫、TdR、nocodazole等綜合處理），可獲得數(shù)量多、同步化效率高的細(xì)胞群。

本研究采用的分離中期染色體的方法是采用1.25 mmol/L HU和10 μmol/L APM的雙阻斷誘導(dǎo)菠菜根尖細(xì)胞有絲分裂中期同步化的方法，將菠菜根尖有絲分裂中期細(xì)胞去壁，并進(jìn)一步裂解細(xì)胞使其釋放染色體。在光鏡下，觀察到用HU-APM雙阻斷法同步化的菠菜根尖的染色體樣品中，可看到大量中期細(xì)胞，且細(xì)胞碎片較少，同步化效果較好，且獲得的中期細(xì)胞染色體形態(tài)清晰完整，便于今后對不同性別類型的菠菜染色體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，進(jìn)而對菠菜的Y染色體進(jìn)行特異性鎖定分析、染色體顯微切割技術(shù)研討、單條染色體基因文庫的構(gòu)建等，同時，也為后續(xù)對菠菜性別決定分子遺傳學(xué)的研究提供了研究基礎(chǔ)。

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（編輯：郭志陽）