楊登會(huì),羅瀾,劉小露,胡杰,吳瑾,賴(lài)福平,陸安靜,喻安永,王瑞烈,2,陸元蘭,2

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.急診科,2.門(mén)診部,貴州 遵義 563003)

自我國(guó)禁用百草枯(paraquat, PQ)以來(lái),敵草快(diquat, DQ)作為一種速效除草劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)[1-2],化學(xué)名稱(chēng)為1,10-乙烯-2,20-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子,分子式為C12H10Br2N2。近年來(lái),DQ中毒患者逐年增多,急性口服DQ中毒成為我國(guó)急診科常見(jiàn)的急危重癥之一。DQ通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)攝入后主要經(jīng)腎臟、消化道等途徑排出,在腎臟中含量最高[3-6]。臨床上,DQ中毒患者可表現(xiàn)為腎臟、肝臟、肺臟、中樞、心臟等多器官功能損傷或衰竭,尤以腎臟損害較為突出,DQ毒代動(dòng)力學(xué)及氧化還原循環(huán)反應(yīng)也證實(shí)腎臟是主要排泄器官及損傷靶點(diǎn)[7-9]。此外,腎臟組織學(xué)分析亦表明,DQ中毒致腎損傷的主要靶點(diǎn)是近曲小管[10]。目前,DQ中毒的機(jī)制尚未完全明確,缺乏特效解毒劑,重癥患者治療效果欠佳、病死率高。而DQ中毒致腎近曲小管損傷可延緩毒物排泄,進(jìn)一步加重全身多器官功能損傷,使患者預(yù)后更差,并發(fā)癥更多[8]。因此,進(jìn)一步探索DQ中毒誘導(dǎo)腎近曲小管損傷的機(jī)制具有重要意義,盡早改善腎功能有益于改善疾病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。

現(xiàn)有研究表明,DQ中毒機(jī)制可能與氧化/抗氧化失衡、炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷、細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)激活及細(xì)胞凋亡等相關(guān)[1-2]。DQ作為一種強(qiáng)氧化劑,通過(guò)觸發(fā)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),致線粒體功能障礙,使腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)腎近曲小管細(xì)胞毒性。其中線粒體既是氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源,也是ROS損害的重要靶點(diǎn)。過(guò)量的ROS可誘導(dǎo)線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡,致線粒體功能障礙[11]。相反,DQ中毒所產(chǎn)生的過(guò)量ROS可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜去極化,觸發(fā)線粒體自噬,以清除受損或冗余的線粒體并維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡,從而減輕急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)。目前,關(guān)于線粒體自噬如何減輕DQ中毒后AKI的具體機(jī)制尚未完全明確,本文作者將對(duì)線粒體自噬在DQ中毒致腎近曲小管損傷中的保護(hù)作用予以綜述。

1 DQ中毒導(dǎo)致腎近曲小管線粒體氧化損傷

腎臟作為DQ蓄積的主要部位及排泄的主要通道,是DQ中毒的主要靶器官之一。臨床上,重癥DQ中毒患者往往易并發(fā)AKI,盡管現(xiàn)有治療措施如血液透析等可清除毒素及水分、調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡,從而緩解AKI,但因缺乏DQ特效解毒劑,仍有部分病人可遺留急性腎衰竭(ARF)等并發(fā)癥,預(yù)后差。因此,進(jìn)一步探索DQ中毒后AKI治療的新策略有助于提高患者生存率及生活質(zhì)量,減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)[12]?，F(xiàn)有研究表明,DQ中毒致AKI可能與以下兩點(diǎn)相關(guān):一方面,DQ中毒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可產(chǎn)生過(guò)量的ROS,致線粒體功能障礙,促使腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡;另一方面,研究發(fā)現(xiàn)DQ主要蓄積于腎臟近曲小管上皮細(xì)胞,且DQ的分子結(jié)構(gòu)與腎毒素(奧萊毒素)相似都具有腎臟毒性,從而致腎近曲小管功能損傷,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[12-13]。線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝平衡的關(guān)鍵細(xì)胞器,在細(xì)胞代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。線粒體作為一種防御機(jī)制,其內(nèi)穩(wěn)態(tài)在能量代謝中起核心作用,是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源,也是ROS損傷時(shí)作用的重要靶點(diǎn)[15]。DQ中毒后誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激致過(guò)量的ROS及活性氮(reactive nitrogen species, RNS)產(chǎn)生,而當(dāng)線粒體內(nèi)ROS累積到最大閾值時(shí)可觸發(fā)線粒體內(nèi)膜的陰離子通道開(kāi)放,使線粒體基質(zhì)釋放大量ROS,導(dǎo)致腎近曲小管線粒體氧化損傷。由此可見(jiàn),線粒體氧化損傷與DQ中毒致腎近曲小管損傷的發(fā)生密切相關(guān)。

1.1 DQ中毒誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及線粒體損傷

DQ中毒打破氧化還原平衡使ROS過(guò)量產(chǎn)生,致使腎近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡,激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)通路,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,損害線粒體功能,使ROS過(guò)量產(chǎn)生致線粒體膜去極化,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙,DQ中毒后引起氧化應(yīng)激、缺血缺氧損傷等損害腎近曲小管上皮細(xì)胞,導(dǎo)致其壞死,最終使腎臟排泄功能急劇下降,毒性物質(zhì)進(jìn)一步堆積,導(dǎo)致惡性循環(huán)。研究表明,氧化還原電位值(redox potential, E0)作為衡量電子親和力的最佳指標(biāo),DQ主要以擴(kuò)散的形式通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入腎近曲小管上皮細(xì)胞,因DQ中含有相對(duì)較高的E0,因此DQ中毒導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損害程度嚴(yán)重[16]。在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)和細(xì)胞色素還原酶(P450)的作用下,DQ中毒通過(guò)氧化還原循環(huán)過(guò)程將高度不穩(wěn)定DQ自由基上的電子NADP+和陽(yáng)離子自由基(DQ+.)轉(zhuǎn)移給分子氧(O2),產(chǎn)生大量超氧化物陰離子自由基(O2.+),同時(shí)DQ+.失去一個(gè)電子轉(zhuǎn)化為DQ2+,通過(guò)連續(xù)不斷的循環(huán)氧化還原過(guò)程產(chǎn)生大量的O2.+[17],與O2發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生 H2O2和O2,最終使腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)合成過(guò)程中斷及細(xì)胞死亡途徑激活。氧化應(yīng)激的重要性現(xiàn)已被普遍證實(shí)[18-19],是造成繼發(fā)性線粒體損傷的主要原因,損傷后的線粒體使細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)顯著降低、ROS生成明顯增加,兩者均為加重DQ中毒后繼發(fā)性腎損傷的重要因素。因此,DQ中毒引起線粒體損傷的機(jī)制與中毒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)之間存在密切的關(guān)系。

1.2 DQ中毒致線粒體損傷與腎近曲小管損傷

腎臟是富含線粒體、能量消耗最高的器官之一,通過(guò)線粒體產(chǎn)生的ATP維持基本功能[20]。腎臟不同腎單位節(jié)段的能量需求及線粒體密度不同,其中腎近曲小管通過(guò)機(jī)體高能量供應(yīng)來(lái)對(duì)抗化學(xué)梯度以發(fā)揮重吸收及分泌功能,故腎近曲小管中富含產(chǎn)ATP的線粒體[21]。線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP生成減少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、腎功能喪失,在DQ中毒腎臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。DQ中毒所致的AKI發(fā)生率較高,腎近曲小管上皮細(xì)胞是其損傷的關(guān)鍵靶細(xì)胞,而線粒體損害在其間發(fā)揮重要的作用。據(jù)報(bào)道,DQ中毒后誘導(dǎo)氧化應(yīng)激致腎近曲小管線粒體清除ROS的能力低下,致使ROS堆積,過(guò)高的ROS水平通過(guò)抑制線粒體氧化磷酸化過(guò)程下調(diào)細(xì)胞色素C(cytochrome C, cytC)氧化酶活性,最終導(dǎo)致線粒體功能障礙,表現(xiàn)為線粒體ROS生成增加、膜電位降低、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性降低、丙二醛(malondialdehyde, MDA)濃度升高[22];另外也有研究發(fā)現(xiàn),DQ中毒引起的AKI可通過(guò)開(kāi)放介導(dǎo)線粒體基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或物質(zhì)傳遞的非特異通道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability pransition pore, mPTP),進(jìn)而啟動(dòng)線粒體通透性轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致氧化應(yīng)激、Ca+毒性,增加促凋亡介質(zhì)的釋放,從而損傷線粒體功能、誘導(dǎo)腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡[21]。因此,線粒體是AKI發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié),線粒體損傷在DQ中毒致腎近曲小管氧化損傷中發(fā)揮重要作用。

2 線粒體損傷與線粒體自噬的相關(guān)性

線粒體損傷是DQ中毒后AKI的主要機(jī)制之一,線粒體的氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、自噬異常等是引起線粒體損傷的重要原因。線粒體自噬是巨自噬的一種,損傷的線粒體由自噬膜包裹形成自噬體,而后與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而被降解吞噬。這種方式可以保證線粒體的質(zhì)量,減少損傷的線粒體釋放過(guò)多的ROS、促凋亡物質(zhì)等,避免對(duì)細(xì)胞造成進(jìn)一步的損傷。DQ中毒誘導(dǎo)氧化應(yīng)激致使ROS 大量聚積于線粒體內(nèi)膜,導(dǎo)致線粒體受損及腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡,機(jī)體為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激及線粒體損傷,在線粒體膜去極化時(shí)觸發(fā)了自噬。在近曲小管上皮細(xì)胞受損之前,線粒體自噬作為機(jī)體的自我防御機(jī)制,能選擇性地隔離并降解掉功能失調(diào)的線粒體[23],從而阻斷過(guò)量ROS的產(chǎn)生。線粒體自噬可通過(guò)自噬小體特異性吞噬降解受損線粒體,在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞器損傷等可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體融合與裂變失衡,激活線粒體自噬,導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展[24]。因此,線粒體融合與裂變失衡是線粒體自噬發(fā)生的先決條件,線粒體自噬激活主要表現(xiàn)為線粒體及自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,ATG) 上游蛋白在自噬小體形成位點(diǎn)處聚集,Parkin泛素化受損線粒體。泛素化的線粒體及ATG 上游蛋白與自噬小體形成位點(diǎn)相互作用后,受損線粒體通過(guò)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3) 與自噬小體結(jié)合并被降解掉。線粒體自噬的激活是線粒體對(duì)氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵適應(yīng)性反應(yīng),主要由受體非依賴(lài)性機(jī)制調(diào)節(jié),該機(jī)制基于PTEN 假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)/E3泛素連接酶Parkin誘導(dǎo)的有絲分裂通路、Bcl-2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3/Nip3 樣蛋白X通路和 FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白 1(FUN14 domain-containing protein 1, FUNDC1)通路發(fā)揮作用[25]。因此,腎組織線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)依賴(lài)于自噬清除功能障礙線粒體。

3 線粒體自噬在DQ中毒腎近曲小管損傷中的保護(hù)作用

DQ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后觸發(fā)的線粒體自噬具有腎臟保護(hù)作用[26],在清除DQ誘導(dǎo)的受損線粒體過(guò)程中,觀察到有絲分裂相關(guān)自噬蛋白的表達(dá)上調(diào),如Pink1、Parkin、LC3-II和LC3-I表達(dá)增加[27];AKI 時(shí)近端腎小管上皮細(xì)胞中自噬現(xiàn)象增多,表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增多、自噬流的暢通、電鏡下自噬體形成增多。證實(shí)在自我防御的基礎(chǔ)上機(jī)體能在受損線粒體損傷腎小管之前選擇性清除、吞噬功能障礙線粒體,說(shuō)明線粒體自噬能對(duì)抗腎近端小管上皮細(xì)胞中的線粒體代謝應(yīng)激及DQ中毒所致AKI[28],最終發(fā)揮腎臟保護(hù)的作用[29]。研究發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注腎損傷中PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬增多,通過(guò)特異性敲除自噬蛋白能顯著增加線粒體損傷、ROS產(chǎn)生,使肌酐升高、腎小管損傷評(píng)分增加、細(xì)胞凋亡增加,腎損傷明顯加重[30],證實(shí)線粒體自噬在缺血再灌注損傷所致AKI的病理生理?xiàng)l件下,在線粒體動(dòng)力學(xué)、腎小管上皮細(xì)胞及腎功能保護(hù)中扮演重要角色。激活線粒體自噬以清除受損線粒體是線粒體對(duì)DQ中毒后氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵適應(yīng)性反應(yīng),FUNDC1為哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)新型線粒體自噬相關(guān)受體,生理?xiàng)l件下,FUNDC1在腎小管中表達(dá)豐富,在介導(dǎo)線粒體自噬激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用[31],FUNDC1通過(guò)LC3相互作用區(qū)(LC3-interacting region, LIR)結(jié)構(gòu)域與LC3相互作用,募集自噬膜泡后包裹線粒體以選擇性介導(dǎo)線粒體自噬。現(xiàn)有不少學(xué)者推論,DQ中毒致腎近曲小管線粒體功能障礙,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激刺激后可能通過(guò)激活FUNDC1依賴(lài)性的線粒體自噬以減輕中毒所致的AKI,可望為臨床DQ中毒患者提供治療新靶點(diǎn)。

4 線粒體靶向治療及線粒體自噬在DQ中毒中的新思路

DQ中毒目前尚無(wú)特效解毒劑,故其病死率高,預(yù)后差。與PQ相比,DQ中毒后腎損害較重而肺纖維化較輕,因?yàn)镈Q中毒毒性主要蓄積于腎臟。DQ中毒導(dǎo)致AKI,與ROS依賴(lài)性腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān),主要為腎近曲小管線粒體清除ROS能力低下,導(dǎo)致ROS累積,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙。研究表明,在該過(guò)程中通過(guò)外源性補(bǔ)充線粒體靶向抗氧化劑-mitoTEMPO/質(zhì)體醌基癸基三苯基鏻的類(lèi)似物10-(6′-plastoquinonyl) decylrhodamine-19(SkQR1)能起到腎臟保護(hù)的作用[32-33]。過(guò)氧化物酶體增殖物受體共激活因子1α(proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)是線粒體生物合成的主要調(diào)節(jié)因子,高度表達(dá)于腎臟近端小管中,與其他因子共同作用促進(jìn)線粒體生物合成,研究證實(shí),腎臟中PGC-1α的表達(dá)水平與中毒后AKI的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),過(guò)表達(dá)PGC-1α-線粒體生物合成激活劑-AMPK激活劑、 AICAR、SIRT1激動(dòng)劑SRT1720和白藜蘆醇等,可以促進(jìn)AKI的腎臟修復(fù)過(guò)程[34]。同時(shí)研究證實(shí),中毒后線粒體裂變/融合失衡,過(guò)度裂變致使線粒體破裂,通過(guò)抑制裂變過(guò)程-線粒體裂變/線粒體自噬抑制劑(Mdivi-1)及特異性敲除腎近曲小管線粒體裂變的關(guān)鍵因子-線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp 1)可以保護(hù)小鼠免受DQ中毒后誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞凋亡及腎臟損害。研究發(fā)現(xiàn),鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(環(huán)孢素A)(cyclosporin A, CsA)作為mPTP的強(qiáng)效抑制劑[35],低劑量CsA通過(guò)抑制mPTP開(kāi)放,進(jìn)而改善線粒體腫脹、恢復(fù)線粒體功能,從而減輕腎細(xì)胞損傷[36]。mTOR 抑制劑雷帕霉素上調(diào)自噬以減輕AKI,但具體機(jī)制尚未明確。以上結(jié)果表明,DQ中毒后通過(guò)外源性抗氧化治療、線粒體自噬激活劑、過(guò)表達(dá)線粒體生物合成、抑制mPTP等過(guò)程的相互作用,最終減輕中毒所導(dǎo)致的AKI。

綜上,DQ中毒誘導(dǎo)線粒體自噬以減輕氧化應(yīng)激所致的腎臟線粒體氧化損傷,線粒體自噬的靶向抗氧化劑及促有絲分裂激動(dòng)劑對(duì)DQ中毒所致的腎臟損害具有保護(hù)作用。通過(guò)自噬可以減輕DQ中毒致腎臟損害的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度、修復(fù)受損線粒體形態(tài)及功能,最終改善DQ中毒的腎功能預(yù)后。應(yīng)進(jìn)一步探究線粒體自噬及線粒體抗氧化治療具體機(jī)制,以期為DQ中毒致腎近曲小管損傷的合理化、規(guī)范化、系統(tǒng)化治療提供臨床依據(jù)。