張玉南,陳科,蔡曉剛,陳嘉偉,紀璘,王云飛,張小雪,董盛蓉,占強,安方梅

[南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院 消化內科,南京醫(yī)科大學無錫醫(yī)學中心,國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心(西安)江蘇分中心,江蘇 無錫 214023]

國際癌癥研究機構2018年發(fā)布的全球癌癥新發(fā)病例統(tǒng)計顯示,在全球范圍內胃癌仍然是最重要的癌癥之一,位居全球第五大最常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。我國的胃癌發(fā)病率和死亡率長期位居世界前列,2015年我國新增胃癌患者67.91萬例,死亡49.8萬例[2]。根據(jù)Lauren病理分型腸型胃癌的發(fā)生經歷慢性非萎縮性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃腺癌過程,是一個多階段、多步驟的過程,假如在疾病早期階段就能及時發(fā)現(xiàn)、干預,對于改善患者預后有著重要的作用。國際癌癥研究機構和WHO就將幽門螺桿菌(Hp)定義為I類致癌原[3]。腸上皮化生發(fā)生于胃黏膜萎縮基礎上,為重要的胃癌前病變,但發(fā)病機制不清楚。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子,通常認為它們并不編碼蛋白,而是以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳調控、轉錄調控及轉錄后調控等)參與蛋白編碼基因調控[4]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs在胃癌發(fā)病中起到關鍵的調控作用[5],Hp感染后引起LncRNAs的表達異常,胃癌組織中鑒定到的差異表達的LncRNA可能與Hp相關的胃病的發(fā)展有關[6]。然而,胃黏膜癌變過程中LncRNAs的表達譜以及與Hp感染的關系目前尚無研究報道。因此,本研究利用高通量測序對慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)、慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、腸上皮化生(intestinal metaplasia, IM)、異型增生(dysplasia, Dys)及胃癌(gastric cancer, GC)中LncRNAs的表達譜進行分析。生物信息學方法基因本體(gene ontology,GO)及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路分析對差異表達LncRNAs所調控的功能及信號通路分別進行了分析。進一步利用較大樣本量對芯片數(shù)據(jù)進行qRT-PCR驗證,并探討了差異表達LncRNAs與Hp感染的關系。本研究結果為Hp感染相關胃癌前病變甚至GC發(fā)病機制的研究提供新思路,為GC的早期干預研究提供理論支持及可能的靶點分子。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月至2020年12月在南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院行胃鏡檢查胃黏膜活檢組織標本,其中CSG、CAG、IM、Dys及GC組織標本各3例,-80 ℃液氮保存,用于高通量測序檢測。為了驗證測序結果的可靠性,我們又收集2020年1月至2020年12月在南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院行胃鏡檢查胃黏膜活檢組織標本共143例,將樣品迅速在液氮中冷凍,-80 ℃保存用于qRT-PCR驗證。143例病人的臨床標本包括85例CSG、26例CAG、15例IM、28例Dys和4例GC。臨床標本的病理結果均由我院兩位具有副主任醫(yī)師職稱的病理科醫(yī)生共同診斷。本研究通過南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 胃黏膜組織總RNA的提取

取胃黏膜組織約50 g,加入1 000 μl Trizol后勻漿。勻漿液轉移至新的EP管,室溫靜置5 min。12 000 r·min-14 ℃離心5 min,取上清,移入新的EP管。加入三氯甲烷200 μl,混勻后常溫放置5 min,12 000 r·min-14 ℃離心10 min,棄上清,留沉淀。加入異丙醇750 μl,混勻后常溫放置10 min,12 000 r·min-14 ℃離心10 min,棄上清,留沉淀。加入1 ml 75%乙醇清洗沉淀,7 500 r·min-14 ℃離心5 min后盡量吸盡酒精,沉淀室溫干燥,最后用10～20 μl RNase Free dH2O溶解。用酶標儀測定提取的RNA樣品的濃度及OD值(A260/280)。

1.3 高通量測序

抽提樣品的總RNA 后,利用去核糖體試劑盒將rRNA去除,并將RNA片段化(平均片段長度為200 nt左右),逆轉錄合成單鏈cDNA,再合成雙鏈cDNA 并純化,末端修復并加接頭引物,PCR 擴增并純化,然后對文庫進行質檢,最后上機測序。獲得原始測序數(shù)據(jù)(Raw Data)后,首先需要對數(shù)據(jù)進行過濾、去接頭序列以及對低質量reads進行處理,再對測序質量進行評估,去除核糖體RNA,獲得高質量數(shù)據(jù)(Clean Data)。

1.4 GO和KEGG富集分析

GO是一種在線分析工具,可以對每一個基因進行功能注釋,并通過超幾何分布方法計算出特定一系列基因中最為顯著的功能?；蚬δ芨患治鲋饕譃閮刹?基因功能注釋、富集分析。將表達差異顯著的基因(|log2(差異倍數(shù))|>1 且Q值<0.05)分為上調和下調,分別進行GO 分析,得到分析結果。

生物通路(Biological Pathway)分析基于KEGG生物學通路數(shù)據(jù)庫(http:∥www.genome.jp/)?；蚬δ芨患治鲋饕譃閮刹?基因KEGG 生物通路注釋、富集分析。P<0.05具有統(tǒng)計學意義。將表達差異顯著的基因(|log2(差異倍數(shù))|>1且Q值<0.05)分為上調和下調,分別進行KEGG分析,得到分析結果。

1.5 qRT-PCR

利用抽提得到的總RNA,反轉錄cDNA為模板。內參 GAPDH 引物序列為:上游5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′,下游5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3′;XR_940570引物序列為:上游5′-GGTAAATGGAAAGAAATCACAGCC-3′,下游5′-TGACACAACACCCAACGAGAA-3′;XR_001746081引物序列為:上游5′-ATCACAACTTGCTGGAGCAGA-3′,下游5′-TCTGACTTGTTGACACTGAGCCT-3′。qRT-PCR反應條件為:95 ℃預變性 45 s,75 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,35個循環(huán),以2-ΔΔCt表示待檢測的基因的表達。

1.6 Hp感染檢測

所有患者在接受胃鏡檢查前均接受Carbon-13(13C)尿素呼氣試驗檢測,并且排除在呼氣試驗前1個月內有抗生素服用史、半個月內有質子泵抑制劑及H2受體阻斷劑服用史者,13C尿素呼氣試驗陽性被認定為Hp感染陽性。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)資料以表示,兩組間比較采用非配對t檢驗。Fold change及P值用于評估不同胃黏膜病變中差異表達的LncRNAs。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同胃黏膜病變中LncRNAs的表達譜

為了了解胃黏膜癌變過程中LncRNAs差異表達情況,利用Illumina HiSeqTM 2500對在CSG、CAG、IM、Dys及GC中表達的LncRNAs譜進行測序分析,火山圖顯示了所有差異具有統(tǒng)計學意義的LncRNAs個數(shù)。與CSG組相比,CAG組中異常表達的LncRNAs共有104個,其中表達上調的LncRNAs有79個,表達下調的LncRNAs有25個(圖1A),熱圖顯示了胃黏膜從炎癥向萎縮變化過程中上調或下調大于20倍的LncRNAs(圖1B)。IM組中異常表達的LncRNAs共有686個,其中表達上調的LncRNAs有403個,表達下調的LncRNAs有283個(圖1C),熱圖顯示了胃黏膜從炎癥向腸上皮化生過程中上調或下調大于20倍的LncRNAs(圖1D)。Dys組中異常表達的LncRNAs共有378個,其中表達上調的LncRNAs有219個,表達下調的LncRNAs有159個(圖1E),熱圖顯示了胃黏膜從炎癥向腸異型增生過程中上調或下調大于20倍的LncRNAs(圖1F)。GC組中異常表達的LncRNAs共有2 180個,其中表達上調的LncRNAs有1 276個,表達下調的LncRNAs有904個(圖1G),熱圖顯示了胃黏膜癌變后上調或下調大于20倍的LncRNAs(圖1H)。

A.CSG與CAG中表達差異LncRNAs的火山圖;B.CSG與CAG中差異表達LncRNAs的熱圖;C.CSG與IM中表達差異LncRNAs的火山圖;D.CSG與IM中差異表達LncRNAs的熱圖;E.CSG與Dys中表達差異LncRNAs的火山圖;F.CSG與Dys中差異表達LncRNAs的熱圖;G.CSG與GC中表達差異LncRNAs的火山圖;H.CSG與GC中差異表達LncRNAs的熱圖

根據(jù)以上測序結果,進一步篩選得到CAG、IM、Dys及GC 4組中表達均有變化的LncRNAs(圖2A)。為了進一步了解在癌前病變中起關鍵作用的LncRNAs,我們將感興趣的兩個LncRNAs XR_001746081和XR_940570在CSG、CAG及Dys中進行擴大樣本量qRT-PCR驗證。結果發(fā)現(xiàn),與CSG相比,XR_001746081和XR_940570在CAG中表達均明顯上調(P<0.001),而在Dys中表達均較CAG中明顯下調至CSG同等水平(P<0.001)(圖2B、C)。推測這兩個LncRNAs可能在胃黏膜由炎癥變?yōu)槲s過程中起重要作用。

A.4組中表達均有差異的LncRNAs的熱圖,熱圖右側代表差異標的LncRNAs的名稱,右側指示條代表表達量的高低(3至-3),紅色代表高表達,藍色代表低表達;B.qRT-PCR檢測XR_940570在CSG、CAG、Dys中的表達,a P<0.001;C.qRT-PCR檢測XR_001746081在CSG、CAG、Dys中的表達,a P<0.001

2.2 差異表達LncRNAs的GO和KEGG信號通路分析

我們對上面篩選得到的在4個組中表達均有變化的27個LncRNAs進行了GO分析,發(fā)現(xiàn)上調的LncRNAs主要調控細胞成分(細胞外基質、細胞內、膜結合細胞器、細胞器、胞質部分、細胞質、膜)、分子功能(底物特異性跨膜轉運活性、跨膜轉運活性、離子結合、水解酶活性、轉運活性、蛋白結合、催化活性)、生物學過程(初級代謝過程、細胞代謝過程、小分子代謝過程、刺激反應、有機物代謝過程、單個有機體代謝過程、細胞形成過程)(圖3A)。下調的LncRNAs主要調控生物學功能(細胞過程、生物過程、生物調節(jié))、細胞成分(細胞、質膜、細胞內)、分子功能(蛋白結合、催化活性)(圖3B)。

A.上調LncRNAs的GO分析;B.下調LncRNAs的GO分析;C.上調LncRNAs的KEGG分析;D.下調LncRNAs的KEGG分析

對上述27個差異表達LncRNAs進行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)上調的LncRNAs主要富集在代謝通路、脂肪消化吸收、脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)、淀粉蔗糖代謝、維生素消化吸收等(圖3C)。下調的LncRNAs主要富集在腫瘤、胃酸分泌、cAMP信號通路、Wnt信號通路、神經活性配體-受體相互作用等(圖3D)。

2.3 XR_940570和XR_001746081表達與Hp感染的關系

CSG組中Hp感染陽性率為41%(35/85), CAG組中Hp感染陽性率為65%(17/26),Dys組中Hp感染陽性率為35.7%(10/28)。CSG與CAG組中Hp感染陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。Dys與CSG組中Hp感染陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1)。

表1 患者的一般資料

進一步對不同Hp感染狀態(tài)下 XR_940570和XR_001746081的表達分析發(fā)現(xiàn),與CSG相比,XR_940570在CAG中表達上調,且在伴有Hp感染的CAG中的上調更為顯著,但在Dys組中,無論Hp感染與否,XR_940570的表達均無顯著差異,見圖4。與CSG相比,XR_001746081在CAG中表達上調,且在Hp感染的CAG中的上調更為顯著,但在Dys組中,無論Hp感染與否,XR_001746081的表達均無顯著差異,見圖5。

NS P>0.05;a P<0.01;b P<0.001

NS P>0.05;a P<0.05;b P<0.01;c P<0.000 1

3 討 論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),LncRNAs可調節(jié)胃癌細胞的增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲轉移[7-9],研究發(fā)現(xiàn),高侵襲轉移胃癌細胞系SGC7901M中MALAT1的水平明顯高于低侵襲轉移胃癌細胞系SGC7901NM,并驗證了MALAT1可以通過促進上皮間質轉化促進胃癌細胞的侵襲和轉移[10]。LncRNA HOXA11-AS僅在胃癌中高表達,在其他腫瘤中不高表達,且LncRNA HOXA11-AS的高表達與胃癌的不良預后相關,沉默LncRNA HOXA11-AS后發(fā)現(xiàn)胃癌細胞增殖受到抑制,促進腫瘤細胞的凋亡[11]。因此可見,LncRNAs在胃癌的發(fā)展中起到關鍵的調控作用,但目前有關LncRNAs在胃黏膜癌前病變中表達的研究罕見。我們利用高通量測序對CSG、CAG、Dys及GC中LncRNAs表達譜進行了分析,發(fā)現(xiàn)在胃黏膜從炎癥至癌變過程中LncRNAs的表達發(fā)生了顯著變化,并驗證了XR_001746081和XR_940570在慢性萎縮性胃炎中高表達,推測這兩個LncRNAs可能在胃黏膜從炎癥到萎縮進展中起到關鍵調控作用。

GO和KEGG分析是基因表達所調控的功能和信號通路常用的預測方法,對于LncRNAs所調控的網絡有著很好的預測價值[12]。本研究將高通量測序得到的異常表達LncRNAs進行了生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)異常表達的LncRNAs主要與代謝、消化、腫瘤、胃酸分泌、cAMP信號通路、Wnt信號通路等相關。由此推測LncRNAs可能通過調控這些信號通路從而參與胃黏膜從炎癥-萎縮-異型增生-GC過程的進展,這為今后癌前病變發(fā)病機制的研究提供了新思路及研究方向。

Hp感染與胃黏膜萎縮、腸化生、上皮內瘤變及GC有關,是GC發(fā)生的獨立危險因素[13]。有研究報道,Hp陽性的萎縮性胃炎患者發(fā)生GC的風險是非Hp感染患者的6.4～11.8倍[14],Hp感染可引起LncRNAs的變化從而調控GC的進展[6]。有研究在Hp感染相關的萎縮性胃炎(Hp-GA)和Hp感染相關的胃癌(Hp-GC)中構建了LncRNA-轉錄因子-mRNA網絡。在Hp-GA網絡中,CDX2是核心轉錄因子,在腸化生和胃癌中起著關鍵作用。在Hp-GA和Hp-GC中,FPR1、TFF2、GAST、SST、FUT9、SHH和GATA5被認為是重要的差異表達的基因[12]。但有關LncRNAs在不同Hp感染狀態(tài)癌前病變中的表達尚無研究報道。我們的研究對篩選得到的兩個LncRNAs XR_940570和XR_001746081在不同Hp感染狀態(tài)的CAG及Dys中的表達進行了分析,結果顯示,在Hp陽性感染的背景下,XR_940570和XR_001746081的表達在CAG中均較CSG中顯著上調,在Dys中的表達與CSG差異不顯著,而在Dys中的表達又較CAG下調,由此推測XR_940570和XR_001746081可能在Hp感染背景下胃黏膜從CSG(炎癥)至CAG(萎縮)變化中起到關鍵調控作用,而隨著胃黏膜進一步病變至異型增生,XR_940570和XR_001746081的表達下調至炎癥相當水平,所發(fā)揮的作用也可能逐漸減弱。

研究認為,Hp主要在胃黏膜萎縮前發(fā)揮作用,所以即便根除Hp治療也不能阻斷胃黏膜由萎縮向異型增生甚至癌的進展[14]。因此在Hp感染且已發(fā)生萎縮的胃黏膜中阻斷XR_940570和XR_001746081的表達可能會干預胃黏膜向異型增生甚至癌的進展,這需要更進一步的實驗研究來證實。

本研究尚存在一定的不足,首先研究樣本量有限,尤其是萎縮性胃炎及異型增生的例數(shù)偏少,我們將繼續(xù)收集不同胃黏膜病變的標本,在今后的研究中用更大樣本量來證實我們的結果。本研究雖然篩選得到了在胃黏膜從炎癥至癌變過程中表達差異的LncRNAs,并且推測到在Hp感染后XR_940570和XR_001746081可能在胃黏膜從炎癥向萎縮轉變中起關鍵的調控作用,但目前尚無可靠的體內外萎縮腸化模型對LncRNAs的功能進行進一步研究,我們正在構建患者來源胃萎縮腸化、異型增生等類器官模型以及比格犬GC模型,待模型穩(wěn)定后將會進一步研究相關lncRNAs的功能。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)XR_940570和XR_001746081在Hp感染后胃黏膜由淺表性胃炎發(fā)展為萎縮性胃炎中可能起到關鍵調控作用,可為Hp感染后胃黏膜癌變的發(fā)病機制的研究提供了新的研究思路。