趙曉娟,魏珂,高雋,靳新星,董菲

(咸陽市第一人民醫(yī)院 婦科,陜西 咸陽 712000)

上皮性卵巢癌癥(epithelial ovarian cancer,EOC)占所有類型卵巢癌(ovarian cancer,OC)病例的90%,其特征是組織病理學(xué)、臨床和分子異質(zhì)性[1-2]。EOC確切病因仍不清楚[3],不良結(jié)局與延遲診斷以及耐藥腫瘤細(xì)胞的持續(xù)存在有關(guān)[4-5]。對(duì)于晚期疾病,通常無法經(jīng)手術(shù)治療[6]。為了改善這些患者的預(yù)后,迫切需要具有高靈敏度和特異度的無創(chuàng)快速診斷方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是19～25個(gè)核苷酸的小非編碼RNA,可以通過與互補(bǔ)的靶mRNA雜交來調(diào)節(jié)基因表達(dá),導(dǎo)致mRNA降解或直接抑制翻譯[7]。miRNA為人類基因表達(dá)提供了一種新的調(diào)控機(jī)制,并在多種生物過程中發(fā)揮重要作用[8]。尤其是存在于循環(huán)外泌體中的miRNA,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,被認(rèn)為是多種病理機(jī)制中有價(jià)值的生物標(biāo)志物來源之一[8-9]。miR-200c是miR-200家族成員,其表達(dá)失調(diào)與OC的發(fā)生發(fā)展和耐藥性密切相關(guān)[10-11]。它可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲性、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移來充當(dāng)腫瘤促進(jìn)劑[11]。另外,miR-200c過表達(dá)可改善不同類型癌癥(包括OC)對(duì)各種化療藥物的反應(yīng),并且其低表達(dá)與獲得性耐藥有關(guān)[10,12]。神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin1,NRP1)是一種跨膜糖蛋白,已被證明在腫瘤發(fā)生、癌癥侵襲和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。據(jù)報(bào)道,NRP1表達(dá)在OC組織中上調(diào),并與OC分級(jí)分期、多藥耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)[14-15]。最近,有研究指出miR-200c可通過靶向NRP1使耐藥的OC細(xì)胞敏感[10]。但血清外泌體miR-200c與NRP1的關(guān)系及其在預(yù)測(cè)OC患者化療反應(yīng)和預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值尚未見報(bào)道。本研究通過分析EOC患者血清外泌體miR-200c表達(dá)與組織NRP1表達(dá)、輔助化療反應(yīng)及預(yù)后的相關(guān)性,以確定miR-200c作為腫瘤生物標(biāo)志物的潛力。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年2月至2022年10月在我院診治的135例新診斷的EOC(112例漿液性、5例黏液性、12例子宮內(nèi)膜樣、6例透明細(xì)胞癌)和30例良性腫瘤(20例漿液性和10例黏液性)患者。收集135例EOC患者的癌組織、48例癌旁正常卵巢組織(距癌組織>2 cm)以及30例良性腫瘤組織樣本,另收集所有參與者的血清(EDTA-K2抗凝劑)樣本,儲(chǔ)存在-20 ℃直至使用。兩組患者年齡相匹配,分別為31～88(64.53±12.19)歲和28～85歲(63.40±15.50)歲,具有可比性(P>0.05)。入選標(biāo)準(zhǔn):病理學(xué)確診,所有患者均有手術(shù)卵巢組織可用;EOC患者接受初級(jí)減瘤手術(shù)和術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)化療。排除標(biāo)準(zhǔn):既往或伴發(fā)其他癌癥或分析用組織材料不足,未完成標(biāo)準(zhǔn)化療方案的EOC患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有受試者均出具書面知情同意書。通過電子病歷獲取EOC患者的臨床特征,包括年齡、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、絕經(jīng)狀態(tài)、國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)分型、殘余腫瘤、化療周期。

1.2 EOC治療及效果評(píng)估

EOC患者根據(jù)FIGO分期系統(tǒng)[16]進(jìn)行分期,并根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)?；颊咴谛g(shù)前3 d采集血清樣本,將術(shù)中新鮮的手術(shù)組織樣本保存在液氮中,隨后制作石蠟包埋(formalin-fixed and parrffin-embedded,FFPE)組織塊,連續(xù)切片后進(jìn)行免疫組化分析。手術(shù)結(jié)果定義為完全細(xì)胞減滅(無肉眼可見腫瘤)、最優(yōu)細(xì)胞減滅(腫瘤<1 cm)或次優(yōu)細(xì)胞減滅(腫瘤>1 cm)。118例EOC患者術(shù)后根據(jù)美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national committee on computer network,NCCN)卵巢癌臨床實(shí)踐指南[17],完成了至少6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)療程的卡鉑5.0～7.5曲線下面積(area under curve,AUC)和紫杉醇175 mg·m-2的化療方案,且具有可分析的化療結(jié)果數(shù)據(jù)。當(dāng)化療完成后>6個(gè)月無復(fù)發(fā)時(shí),視為鉑敏感腫瘤。耐藥患者被定義為原發(fā)性化療難治性患者(盡管接受了一線化療,但仍有進(jìn)展)或化療完成后≤6個(gè)月復(fù)發(fā)。無進(jìn)展生存(progression-free survival,PFS)期被定義為從初次手術(shù)到疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)、死亡或仍活著患者的最后隨訪日期的時(shí)間。總生存(overall survival,OS)期計(jì)算為從手術(shù)日期到任何原因死亡的時(shí)間,或到2023年1月17日的時(shí)間,以先到者為準(zhǔn)。

1.3 血清外泌體提取及特征鑒定

通過血清總外泌體分離試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)分離總外泌體。2 000 r·min-1離心30 min,以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片,取上清液與總外泌體分離試劑在4 ℃孵育30 min,10 000 r·min-1離心10 min,棄上清,將外泌體顆粒重懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中。通過透射電子顯微鏡(日本JEOL JEM-2100Plus)觀察分離的外泌體形態(tài),粒徑分布使用納米顆粒跟蹤分析儀(英國馬爾文NanoSight LM10)檢測(cè)。提取的外泌體質(zhì)量通過蛋白免疫印跡法驗(yàn)證,使用外泌體標(biāo)志物CD63作為陽性指標(biāo),Calnexin蛋白作為陰性對(duì)照,抗體均購自英國Abcam公司。

1.4 血清外泌體miR-200c水平檢測(cè)

使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從外泌體顆粒中提取總RNA。分離RNA的純度由Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定(美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA。在美國Bio-Rad C1000 Touch實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增:95 ℃下進(jìn)行10 min,95 ℃下進(jìn)行10 s,60 ℃下進(jìn)行60 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-200c相對(duì)表達(dá)水平。引物序列:miR-220c正向引物序列5′-CTCGTCTTACCCAGCAGTGTT-3′,反向引物序列5′-CTCCATCATTACCCGGCAGT-3′;U6正向引物序列5′-AGAAGATTAGCATGGCCCCT-3′,反向引物序列5′-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.5 組織NRP1表達(dá)檢測(cè)

手術(shù)時(shí)收集所有組織樣本,進(jìn)行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色分析。將FFPE組織切片(約4 μm厚)用二甲苯脫蠟,在分級(jí)乙醇中再水化。將切片置于pH 9.0的乙二胺四乙酸溶液內(nèi),在95 ℃水浴進(jìn)行30 min抗原修復(fù)。用3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶。將組織用5%山羊血清(美國Dako公司)封閉,依次用一抗(NRP1抗體,ab81321,英國Abcam公司)在4 ℃孵育過夜,二抗在室溫下孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺顯色溶液孵育10 min。切片用蘇木精溶液復(fù)染,DPX封片,用日本Nikon H600L顯微鏡觀察。由兩名病理學(xué)專家對(duì)染色圖像進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估,并根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞的比例使用半定量綜合評(píng)分法進(jìn)行量化:免疫反應(yīng)性評(píng)分(immune reactivity score,IRS)取決于染色強(qiáng)度(stain index,SI)和陽性細(xì)胞的百分比(positive cell percentage,PP),IRS=SI×PP。SI:無色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。PP:陰性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞≤10%為1分,陽性細(xì)胞11%～50%為2分,陽性細(xì)胞51%～100%為3分。IRS:≤1分為陰性表達(dá),>1分為陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS26.0軟件處理數(shù)據(jù)。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(IQR)表示,并進(jìn)行Mann-WhitneyU分析。二分類變量以率或構(gòu)成比表示,并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。使用受試者共作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析血清外泌體miR-200c對(duì)EOC患者鑒別診斷以及化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值。使用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型和Kaplan-Meier法生存曲線分析血清外泌體miR-200c與預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體獲取及鑒定

血清中分離出的囊泡大小約為100 nm(圖1),通過透射電子顯微鏡觀察顯示單層膜囊泡,呈典型的圓盤狀;納米跟蹤分析儀顯示囊泡直徑平均為100 nm。為了確認(rèn)提取的外泌體質(zhì)量,對(duì)外泌體特征蛋白CD63和Calnexin的表達(dá)進(jìn)行了蛋白免疫印跡分析,結(jié)果顯示外泌體標(biāo)記CD63呈陽性表達(dá),Calnexin呈陰性,表明外泌體確實(shí)已充分純化。

A.透射電鏡觀察;B.納米粒徑追蹤分析外泌體粒徑分布;C.外泌體標(biāo)志膜蛋白CD63和Calnexin表達(dá)

2.2 組織中NRP1表達(dá)

經(jīng)IHC分析,NRP1主要表達(dá)于EOC腫瘤細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)中,偶見于癌旁正常卵巢組織和良性腫瘤組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中,見圖2。與良性腫瘤組織(n=30)相比,EOC組織(n=135)中NRP1蛋白陽性表達(dá)率更高[42.22%(57/135)vs. 6.67%(2/30),χ2=13.509,P=0.000 2];EOC組織中NRP1蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁正常卵巢組織[60.42%(29/48vs. 10.42%(5/48),χ2=26.231,P<0.001)]。

A.癌旁正常卵巢組織;B.良性腫瘤組織;C.EOC組織

2.3 兩組血清外泌體miR-200c表達(dá)差異

與良性腫瘤組患者相比,EOC組患者血清外泌體miR-200c表達(dá)水平顯著降低[0.42(0.35,0.60)vs.0.97(0.85,1.08),Z=-8.255,P<0.001],見圖3A。ROC曲線(圖3B)顯示,血清外泌體miR-200c水平可良好地區(qū)分EOC組和良性腫瘤組,曲線下面積(AUC)為0.955(95%CI0.921～0.989),在最佳臨界值(0.78)時(shí),其靈敏度和特異度分別達(dá)到0.867(95%CI0.831～0.897)和0.933(95%CI0.917～0.947)。

A.箱式圖;B.ROC曲線

2.4 EOC患者血清外泌體miR-200c表達(dá)與組織NRP1表達(dá)的關(guān)系

NRP1陽性患者血清外泌體miR-200c表達(dá)水平顯著低于陰性患者[0.36(0.26,0.43)vs.0.50(0.40,0.72),Z=-5.591,P<0.001]。血清外泌體miR-200c水平與組織NRP1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Spearman’sr=-0.483,P<0.001)。

2.5 EOC患者血清外泌體miR-200c水平與其他臨床病理特征關(guān)系

根據(jù)血清外泌體miR-200c表達(dá)中位值,將所有EOC患者分為miR-200c低表達(dá)組(<0.42)和高表達(dá)組(≥0.42)。EOC患者血清外泌體miR-200c低表達(dá)與FIGO分期更高、NRP1陽性表達(dá)有關(guān)(P<0.05),與其他臨床特征和手術(shù)結(jié)局無關(guān)(P>0.05),見表1。

表1 血清外泌體miR-200c水平與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.6 血清外泌體miR-200c水平與化療反應(yīng)的關(guān)系

118例患者完成術(shù)后輔助標(biāo)準(zhǔn)化療后,83例化療敏感,35例化療耐藥(31例化療完成后≤6個(gè)月復(fù)發(fā),4例為原發(fā)性化療難治)?；熌退幗M患者血清外泌體miR-200c表達(dá)水平顯著低于化療敏感組[0.35(0.24,0.40)vs. 0.52(0.42,0.67),Z=-5.930,P<0.001],見圖4A。血清外泌體miR-200c水平預(yù)測(cè)EOC患者化療反應(yīng)的AUC為0.846(95%CI0.769～0.924),對(duì)應(yīng)臨界值為0.41,最佳靈敏度和特異度分別為0.795(95%CI0.769～0.824)和0.829(95%CI0.804～0.840),見圖4B。

A.箱式圖;B.ROC曲線

2.7 預(yù)后分析

將單因素分析中P<0.05的變量作為自變量進(jìn)一步納入多因素Cox回歸分析,預(yù)后作為因變量(生存/無進(jìn)展賦值為0,死亡/疾病進(jìn)展賦值為1)。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,血清外泌體miR-200c低表達(dá)是EOC患者OS和PFS預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05),見表2。

2.8 Kaplan-Meier生存曲線

血清外泌體miR-200c低表達(dá)組和高表達(dá)組患者5年OS率分別為49.3%(33/67)和70.6%(48/68),中位OS期分別為21.90、27.13個(gè)月(Log-rankχ2=10.192,P=0.001),見圖5A。血清外泌體miR-200c低表達(dá)組和高表達(dá)組患者5年P(guān)FS率分別為16.4%(11/67)和33.8%(23/68),中位PFS期分別為14.90、19.23個(gè)月(Log-rankχ2=7.987,P=0.005),見圖5B。血清外泌體miR-200c高表達(dá)組OS和PFS預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組(P<0.05)。

A.血清外泌體miR-200c表達(dá)與OS的關(guān)系;B.血清外泌體miR-200c表達(dá)與PFS的關(guān)系

3 討 論

在過去幾十年中,手術(shù)和化療方案的進(jìn)步使OC的死亡率呈下降趨勢(shì),但它仍然是全球所有婦科惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥[1-2]?；熌退幰殉蔀镋OC有效治療的阻礙[5]。因此,需要尋找有助于監(jiān)測(cè)化療反應(yīng)和預(yù)測(cè)患者生存率的新型可靠生物標(biāo)志物。許多證據(jù)表明血清外泌體miRNA在各種癌癥(包括EOC)中作為生物標(biāo)志物的潛力[7-8]。在本研究中,我們?cè)u(píng)估了EOC患者血清外泌體miR-200c水平的臨床意義,并證明血清外泌體miR-200c與組織NRP1呈負(fù)相關(guān),可以作為預(yù)測(cè)EOC化療反應(yīng)和預(yù)后的有希望的生物標(biāo)志物。

越來越多的證據(jù)表明,miR-200c的異常表達(dá)參與EOC的發(fā)生以及化療耐藥性[10-11]。miR-200c是miR-200家族的成員,可參與多種生物過程如細(xì)胞周期、血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。據(jù)報(bào)道,它在EOC中高表達(dá),可能有助于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲性、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11]。另外,miR-200c的丟失與不同類型癌癥(包括EOC)對(duì)各種化療藥物的獲得耐藥性有關(guān),是各種癌癥化療耐藥性的重要且有前途的調(diào)節(jié)劑[10,12]。例如,Vescarelli等[11]報(bào)道m(xù)iR-200c的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)NRP1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OC細(xì)胞對(duì)奧拉帕尼的耐藥性。NRP1是一種跨膜糖蛋白,已被證明通過激活血管內(nèi)皮生長因子、磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶 B通路在腫瘤發(fā)生、癌癥侵襲和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]。據(jù)報(bào)道,NRP1在EOC中表達(dá)上調(diào),可通過逃避接觸抑制促進(jìn)EOC無限生長,并且其高表達(dá)與EOC較短的生存期相關(guān)[11]。一項(xiàng)全面的生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析表明,NRP1參與OC的多藥耐藥性[15]。miR-200家族的一些miRNA已被證明與NRP1 3′非翻譯區(qū)相互作用,并負(fù)調(diào)節(jié)NRP1信號(hào)傳導(dǎo)[11]。此外,Huang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-200c可通過調(diào)節(jié)壽命蛋白水平增加EOC細(xì)胞對(duì)順鉑治療的敏感性。其他研究也報(bào)告了EOC中miR-200c表達(dá)與紫杉醇和卡鉑耐藥性之間的相關(guān)性[12],上述研究證實(shí)了miR-200c是EOC化療耐藥性的重要影響因素。此外,許多研究提示miR-200c表達(dá)失調(diào)與EOC侵襲性和預(yù)后不良有關(guān)[19-20]?？傊?這些研究結(jié)果提示miR-200c參與調(diào)節(jié)EOC化療耐藥,并且與EOC進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。

最近的研究表明,血清外泌體miRNA在EOC中異常表達(dá),有希望作為EOC的發(fā)生和進(jìn)展的生物標(biāo)志物[6-7]。而在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)化療耐藥患者血清外泌體miR-200c水平低于化療敏感患者,提示術(shù)前血清外泌體miR-200c低表達(dá)與化療耐藥有關(guān),也證明了miR-200c是EOC化療耐藥的相關(guān)因素。而且血清外泌體miR-200c水平在區(qū)分化療耐藥患者和化療敏感性患者方面具有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值。此外,本研究還發(fā)現(xiàn) NRP1陽性患者血清外泌體miR-200c表達(dá)水平顯著低于陰性患者,血清外泌體miR-200c表達(dá)與組織NRP1表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。因此,我們推測(cè)血清外泌體miR-200c可能通過靶向NRP1影響EOC化療耐藥,miR-200c/NRP1軸可能是該腫瘤潛在有價(jià)值的治療靶點(diǎn)。此外,Cox回歸分析顯示,血清外泌體miR-200c低表達(dá)是EOC患者OS和PFS預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且血清外泌體miR-200c低表達(dá)的患者比高表達(dá)的患者具有更短的PFS期和OS期,這提示了血清外泌體miR-200c低表達(dá)在評(píng)估EOC患者預(yù)后不良中的潛在作用。總之,本研究結(jié)果提示血清外泌體miR-200c有希望用于篩查化療耐藥高危風(fēng)險(xiǎn)患者和預(yù)測(cè)EOC患者的預(yù)后,以及用于靶向治療。

綜上,本研究表明血清外泌體miR-200c低表達(dá)與組織NRP1高表達(dá)、化療耐藥及預(yù)后不良有關(guān)。血清外泌體miR-200c可用作預(yù)測(cè)EOC化療反應(yīng)和預(yù)后的有希望的生物標(biāo)志物。但本研究有幾個(gè)局限性,例如本單中心研究中應(yīng)用的樣本量是有限的,而且缺乏機(jī)制研究。因此,有必要研究miR-200c在EOC細(xì)胞系中的調(diào)節(jié)機(jī)制,并在更大的患者隊(duì)列中擴(kuò)大和證實(shí)上述觀察結(jié)果。