童曉東，馬焙焙，彭 敏

南通市中醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara 的根莖。別名苦蕎麥根、蕎麥三七、金鎖銀開、野蕎麥根等，具有清熱解毒、排膿祛瘀、軟堅散結(jié)等功用［1］。南通當(dāng)?shù)赜置F腳將軍草，由南通市中醫(yī)院已故國醫(yī)大師朱良春挖掘于民間。1975 年南通市中醫(yī)院與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合作的“新藥金蕎麥”獲得國家級成果（國家二級甲等科技進(jìn)步獎）。在此基礎(chǔ)上研制的金蕎麥合劑臨床用于治療急性肺膿瘍、喘息型慢性支氣管炎、支氣管哮喘及急、慢性氣管炎等疾?。?-4］。

現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為金蕎麥主要含有黃酮類、萜類以及酚類等化學(xué)成分，主要有（-）表兒茶素-3-O-沒食子酸酯、沒食子酸、表兒茶素、兒茶素、金絲桃苷、原兒茶酸、原花青素B2、木犀草素等［5］，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗癌及止痛、清除自由基等藥理基礎(chǔ)［6-7］。

金蕎麥合劑臨床應(yīng)用效果好，但具有保存時間短，不方便攜帶等缺點(diǎn)，而膠囊則彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn)，提高了藥物的穩(wěn)定性，處方和生產(chǎn)工藝也較簡便?，F(xiàn)在市面上的金蕎麥藥物以金蕎麥為主要藥材，以水煎煮，但提取率低。為有效控制金蕎麥膠囊中間體的質(zhì)量，選擇優(yōu)化金蕎麥膠囊中間體的制備工藝，以醇提取代替煎煮，以沒食子酸、表兒茶素、原花青素B2、兒茶素、原兒茶酸、金絲桃苷、木犀草素等多種主要活性成分為考察指標(biāo)，對金蕎麥的水提、乙醇提取工藝進(jìn)行正交實驗，以多指標(biāo)成分的檢測及浸膏提取率為評分指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。

1 材料

1.1 主要儀器UltiMate3000 高效液相色譜儀、Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 Diode Array and Multiple-Wavelength Detectors 檢測器（Thermo Fisher Scientific 有限公司）；JP-040S 型超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；MS105DU 型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 貿(mào)易有限公司）；BHS-2 型數(shù)顯恒溫雙孔水浴鍋（寧波市群安實驗儀器）；HC-1016高速離心機(jī)（安徽中科中佳）；實驗室級超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；SZ-150A-3型超速多功能粉碎機(jī)（永安善竹貿(mào)易有限公司）；C18 分析色譜柱（Waters 有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N1100DWD（東京理化器械株式會社）。

1.2 藥物與試劑表兒茶素對照品（含量以99.7%計，批號：110878-201703）、沒食子酸（含量以91.5%計，批號：110831-201906）、兒茶素（含量以95.1%計，批號：110877-202005）、原兒茶酸（含量以97.7%計，批號：110809-201906）均由中國藥品生物制品檢定所提供；原花青素B2（含量以91.5%計，批號AF7060703）由成都埃法生物科技有限公司提供；金蕎麥中藥飲片（批號：C0842180072）由保和堂制藥有限公司提供，經(jīng)鑒定檢測為蓼科植物金蕎麥的干燥根；乙腈磷酸、乙醇、甲醇、甲酸、乙酸乙酯（分析純）由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈、甲醇（色譜純）由德國默克公司提供；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照溶液制備精密稱定適量沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素置5 mL容量瓶中，加入甲醇定溶，配置成分別含0.26 mg/mL原花青素B2對照品溶液、0.232 mg/mL沒食子酸對照品溶液、0.29 mg/mL兒茶素對照品溶液、0.35 mg/mL表兒茶素對照品溶液、0.344 mg/mL原兒茶酸對照品溶液，精密量取原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素對照品溶液各1 mL，沒食子酸對照品溶液0.4 mL，置10 mL容量瓶中并用甲醇定溶，配置成含34.4 μg/mL原兒茶酸對照品、29 μg/mL兒茶素對照品、9.28 μg/mL沒食子酸對照品、35 μg/mL表兒茶素對照品、26 μg/mL原花青素B2對照品的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備取金蕎麥提取物0.2 g，加入乙腈-水混合溶液適量，兩者比例10∶90，用超聲波清洗機(jī)超聲溶解（功率250 W，頻率33 kHz），轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，振蕩搖勻，再用離心半徑4 cm，15000 r/min 離心5 min，精密量取上清液，使用濕法上聚酰胺柱（30～60 目、18 cm 長、1.0 cm內(nèi)徑），先用50 mL水洗脫，再用100 mL的95%乙醇洗脫，丟棄水洗脫液，收集乙醇洗脫液，在60 ℃下濃縮至近干，用乙腈-水混合溶液多次溶解，收集至5 mL 容量瓶中，加乙腈-水混合溶液稀釋定容至刻度線。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性條件Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm HPLC column）；流動相以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。檢測波長：278 nm；柱溫：35 ℃。在此色譜條件下沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素能很好分離，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于9000，分離度＞1.5。見圖1—2及表1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 混合對照品溶液

圖2 金蕎麥提取物供試品溶液

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液，分別以2、5、10、20、40、60 μL精密進(jìn)樣，按色譜條件測定沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素色譜峰面積，結(jié)果以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程見表2。

表2 各對照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍（n=6）

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，按色譜方法測定并計算原兒茶酸、沒食子酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的RSD（n=5）分別為1.56%、1.62%、1.34%、1.28%、1.73%，表明供試品溶液在室溫條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5 次，測定峰面積。測得沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的RSD（n=5）分別為1.21%、1.40%、0.67%、0.92%、1.04%，表明儀器精密性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一方法提取制備的樣品，按供試品溶液制備方法，平行制備6 份供試品溶液，依照色譜條件檢測并計算其各成分含量，結(jié)果兒茶素、沒食子酸、原花青素B2、原兒茶酸、表兒茶素含量的RSD 分別為1.45%、1.94%、1.72%、2.04%、1.86%，表明實驗方法具有良好重復(fù)性。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取1 份金蕎麥浸膏0.2 g，依法按照“2.2”方法制成供試品溶液，并在其中加入定量混合標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)進(jìn)樣5針，每針注入10 μL 于高效液相色譜儀，結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的平均回收率分別為93.54%、96.11%、98.17%、96.59%、100.1%，RSD分別為1.75%、2.01%、1.81%、2.57%、1.36%。

2.4.6 得膏率測定 取同一批次金蕎麥中藥飲片（批號：C0842180072）10 g，精密稱定，按試驗設(shè)計條件進(jìn)行提取，提取液合并過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到一定量，再65 ℃干燥至恒重，冷卻30 min，精密稱定。得膏率（%）=干膏/藥材×100%。

2.5 制備工藝優(yōu)選

2.5.1 提取工藝選擇 以乙醇為提取溶媒，溶劑量、溶劑濃度、回流時間是提取過程中比較重要的參考因素，為實現(xiàn)以最少的次數(shù)達(dá)到大量全面試驗等效的結(jié)果，采用三因素三水平正交試驗，見表3。

表3 提取因素和水平

2.5.2 提取工藝綜合評分優(yōu)選 按照L9（34）正交表安排試驗，取9 份金蕎麥藥材，每份金蕎麥根莖10 g，粉碎成粗粉，置于圓底燒瓶中，分別加入對應(yīng)濃度及對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇，與藥材混合進(jìn)行回流提取，濾過，合并濾液，65 ℃濃縮成膏，干燥，即得樣品，以沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素5 種成分含量（金蕎麥藥材成分含量）及得膏率為考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評分，優(yōu)選最佳提取工藝為指標(biāo)篩選制備工藝。樣品中成分含量=（測得樣品成分的濃度×稀釋體積/取膏量）×干膏量）/金蕎麥藥材質(zhì)量。綜合評分（%）=（沒食子酸含量/組內(nèi)最高值×15%+原兒茶酸含量/組內(nèi)最高值×15%+兒茶素含量/組內(nèi)最高值×15%+原花青素B2 含量/組內(nèi)最高值×20%+表兒茶素含量/組內(nèi)最高值×20%+干膏率/組內(nèi)最高值×15%）×100%。見表4。

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.5.3 方差分析結(jié)果 3 個因素中溶劑量和溶劑濃度具有顯著差異，而回流時間顯著水平微乎其微，可不做因素影響考慮，結(jié)合實際工藝生產(chǎn)時間、成本等因素選取回流時間為1.5 h，最佳溶劑量為10倍量，最佳溶劑濃度為55%的乙醇。見表5。

表5 方差分析

2.5.4 驗證性試驗 取3 份金蕎麥粗粉，每份10 g，加入10 倍量55%的乙醇，回流1.5 h，回流2次，在60 ℃下濃縮并蒸發(fā)成金蕎麥干膏。每份金蕎麥干膏對應(yīng)取0.2 g，用乙腈-水混合溶液溶解（10∶90），按照“2.1”方法制成供試品溶液，在相同色譜條件下測得表兒茶素、兒茶素、原花青素B2、沒食子酸、原兒茶酸含量分別是190.178、51.013、323.214、79.542、141.63 μg/g，得膏率為21.54%，RSD 分別為1.27%、2.07%、1.95%、2.11%、1.65%，結(jié)果表明此工藝重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇現(xiàn)代中藥制劑提取工藝已將單一成分、單一因素為考察指標(biāo)改為以多指標(biāo)、多因素綜合評分的方法來優(yōu)選提取工藝，如王玲嬌等［8］以多指標(biāo)綜合評分結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選金卷升板膠囊提取工藝。何前松等［9］多指標(biāo)評價苦參洗液提取工藝。

多指標(biāo)綜合評分是指根據(jù)不同成分在金蕎麥中的含量、作用及在提取中影響因素分配不同占比系數(shù)［10］。原花青素B2、表兒茶素是金蕎麥所含主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用［11］，在本研究綜合評分中各占20%，為了盡可能篩選出最佳工藝，其他成分及得膏率也是重要因素，各占15%，這種設(shè)計能保證提取工藝的科學(xué)性和合理性，能提取出更多更有效的活性成分，保證金蕎麥合劑的臨床效果。

3.2 流動相選擇首先按照藥典標(biāo)準(zhǔn)用乙腈-水（10∶90）作為流動相［7］對對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行分離，結(jié)果表兒茶素在10 分鐘時出峰，但供試品溶液在此時間的分離效果較差，其他成分難以分離?？紤]到要檢測沒食子酸、原兒茶酸、兒茶酸，流動相以乙腈-0.1%磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，最后本試驗梯度洗脫方法能很好分離供試品中各組分，這5種成分可以作為考察指標(biāo)。

3.3 濃縮溫度選擇試驗早期，每次過柱色譜后表兒茶素、兒茶素、沒食子酸等含量不穩(wěn)定甚至?xí)?，查詢文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)兒茶素結(jié)構(gòu)中含有活性酚羥基，這種物質(zhì)結(jié)構(gòu)在中性、堿性環(huán)境下容易發(fā)生改變，在高溫情況下、潮濕和光照等環(huán)境條件下容易發(fā)生氧化聚合、異構(gòu)化等反應(yīng)，使其原有的生物活性發(fā)生改變［12］，在100 ℃條件下兒茶素主要發(fā)生脫沒食子酸和異構(gòu)化反應(yīng)［13］，因此將溫度設(shè)為60 ℃以保持主要成分含量的穩(wěn)定。

3.4 試驗優(yōu)化方法選擇試驗優(yōu)化的常用方法有正交設(shè)計、均勻設(shè)計、單純行優(yōu)化法、拉式優(yōu)化法和效應(yīng)面優(yōu)化法等。本試驗因素較多，因此選擇正交試驗設(shè)計法，正交設(shè)計是一種正交表安排多因素、多水平的試驗，并用普通的統(tǒng)計表分析方法分析試驗的結(jié)果，推斷最佳水平的科學(xué)方法［14］。實現(xiàn)了以最少次數(shù)達(dá)到大量全面實驗等效的結(jié)果，為實驗節(jié)省了大量時間和器材。