王一涵，李佳睿，杜麗坤

1 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

肥胖是由遺傳、環(huán)境等多因素引起的能量代謝紊亂，熱量攝入大于消耗所致的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病。是誘發(fā)心血管疾病、高脂血癥、高血壓、多囊卵巢綜合征等疾病的重要危險(xiǎn)因素［1］。肥胖的發(fā)病受遺傳、飲食、腸道菌群、炎癥因子等多方面影響［2］。病因雖未完全闡明，但肥胖作為一種慢性低度炎癥狀態(tài)被業(yè)界廣泛認(rèn)可［3］。肥胖導(dǎo)致脂肪細(xì)胞因子合成異常，可激活炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，分解過(guò)量游離脂肪酸入血，且脂肪組織前體轉(zhuǎn)化為類(lèi)巨噬細(xì)胞，使炎性因子過(guò)度表達(dá)與釋放，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等［4-5］。研究表明發(fā)生胰島素抵抗（insulin resistant，IR）的重要原因之一是慢性低度炎癥的影響［6］，TNF-α、IL-6、MCP-1、C 反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）等都能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)的發(fā)生，激活炎癥細(xì)胞因子信號(hào)，阻斷胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，引發(fā)IR［7］。

本研究通過(guò)建立肥胖小鼠模型，應(yīng)用連陳湯與辛伐他汀做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察連陳湯對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量、糖脂代謝、附睪脂肪組織的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用40 只SPF 級(jí)8 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。實(shí)驗(yàn)獲得黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批準(zhǔn)許（2019071502）；飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心。

1.2 藥品來(lái)源藥品采購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。連陳湯藥物組成：半夏15 g，黃連6 g，陳皮15 g，茯苓9 g，甘草5 g，加8 倍量水浸泡1 h，文火煎煮2次后合并藥液。藥液經(jīng)四層紗布過(guò)濾后于70 ℃水浴鍋濃縮至含生藥0.38 g/mL，高壓滅菌后于4 ℃恒溫箱保存?zhèn)溆茫恍练ニ∑êＵx瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字20010677，規(guī)格：20 mg）碾碎后用蒸餾水配制成混懸液保存于4 ℃冰箱中，藥物濃度為0.23 mg/mL。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肥胖模型構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，給予普通飼料且單籠飼養(yǎng)。光照周期：12 h 光照/12 h 黑暗；飼養(yǎng)溫度：（25±1）℃；相對(duì)濕度：（60±5）%。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食飲水。1 周后將小鼠隨機(jī)分為空白組10 只，予普通飼料飼養(yǎng)（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；模型組、辛伐他汀組、連陳湯組各10 只予高脂飼料飼養(yǎng)（派克生物技術(shù)有限公司）。連續(xù)飼養(yǎng)4個(gè)月，每4周稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量1次。高脂喂養(yǎng)小鼠體質(zhì)量大于空白組體質(zhì)量的20%即為造模成功。

1.3.2 給藥 給藥期間飼料喂養(yǎng)方式不變。給藥方式和計(jì)量：辛伐他汀組灌胃辛伐他汀混懸液［4.5 mg/（kg·d）］；連陳湯組灌胃連陳湯濃縮液［7.47 g/（kg·d）］；空白組與模型組灌胃等體積純凈水。每日1 次，連續(xù)4 周，給藥期間每周測(cè)量小鼠體質(zhì)量1次。

1.3.3 標(biāo)本取材 小鼠禁食12 h 后腹腔注射4%水合氯醛水溶液（10 mL/kg）麻醉小鼠，眼球取血，離心后取血清置于-80 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙蟮男∈罅⒓粗糜诒猩?，打開(kāi)腹腔→剝離完整附睪脂肪組織→沖洗→濾紙吸干→稱(chēng)重→記錄數(shù)據(jù)→置于4%多聚甲醛固定液中固定。

1.3.4 代謝指標(biāo)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀（日立高科技貿(mào)易上海有限公司）檢測(cè)血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）胰島素水平；尾靜脈采血測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)PG）；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model of insulin resistance index，HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）/22.5）；使用ELISA檢測(cè)試劑盒（哈爾濱市盈夏實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)銷(xiāo)部提供）檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.3.5 附睪脂肪組織HE染色 將4%多聚甲醛固定液中固定的附睪脂肪組織脫水→石蠟包埋→切片→脫蠟→復(fù)水→染色→脫水→透明→固封，待通風(fēng)干燥后于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠附睪脂肪組織形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以xˉ±s表示，若符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用tukey 法，不符合正態(tài)分布時(shí)釆用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化情況飼養(yǎng)16 周時(shí)，高脂飼料3組小鼠體質(zhì)量均高于空白組（P＜0.01）。灌胃4周，空白組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化；模型組小鼠體質(zhì)量增加，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；飼養(yǎng)18周時(shí)辛伐他汀組小鼠體質(zhì)量下降，但不如連陳湯組小鼠體質(zhì)量下降明顯；兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）；飼養(yǎng)17 周時(shí)連陳湯組小鼠體質(zhì)量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組小鼠治療前后體質(zhì)量變化趨勢(shì)

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況（xˉ±s） g

2.2 小鼠糖代謝水平變化情況與空白組相比，高脂飼料3組小鼠FINS水平、HOMA-IR增高（P＜0.01）。與模型組比較，連陳湯組FINS 及HOMA-IR 水平降低（P＜0.01）；辛伐他汀組FINS及HOMA-IR下降不明顯（P＞0.05）。FPG水平模型組高于空白組（P＜0.01）；高脂飼料3組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠FPG、FINS及HOMA-IR比較（xˉ±s）

2.3 小鼠脂代謝水平變化情況與空白組比較，模型組小鼠血脂水平TG、TC 升高（P＜0.01）。與模型組相比，TC、TG 水平連陳湯組和辛伐他汀組均下降（P＜0.01），辛伐他汀組與連陳湯組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠TG與TC比較（xˉ±s） mmol/L

2.4 小鼠附睪脂肪組織變化情況空白組小鼠脂肪細(xì)胞形態(tài)規(guī)整；模型組小鼠脂肪細(xì)胞體積增大，細(xì)胞數(shù)量減少，脂滴含量較高；與模型組比較，連陳湯組脂肪細(xì)胞體積縮小，脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，脂滴含量下降，辛伐他汀組小鼠脂肪細(xì)胞體積與細(xì)胞大小略減小但不明顯，脂肪細(xì)胞數(shù)量變化不明顯。模型組小鼠的附睪脂肪組織質(zhì)量高于空白組，連陳湯組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量較模型組降低（P＜0.01），脂肪積累減少，連陳湯組與辛伐他汀組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 各組小鼠附睪脂肪組織形態(tài)（HE，×400）

表4 各組小鼠附睪脂肪組織質(zhì)量（xˉ±s）g

2.5 小鼠炎癥因子變化情況與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.01）；辛伐他汀組血清TNF-α水平降低（P＜0.05）；IL-6、IL-1β水平與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），連陳湯組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平較模型組降低（P＜0.01）；連陳湯組TNF-α、IL-6、IL-1β水平低于辛伐他汀組（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠炎癥因子水平比較（xˉ±s） pg/mL

3 討論

近年來(lái)肥胖的發(fā)生率逐漸增多且呈年輕化，成為危害健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，肥胖是攝入過(guò)多或消耗減少導(dǎo)致的脂肪大量累積，血脂代謝紊亂是引起代謝綜合征的重要因素之一，尤其內(nèi)臟脂肪的增加與IR 的發(fā)生關(guān)系密切［8-9］。白色脂肪會(huì)不斷擴(kuò)增，導(dǎo)致TNF-α、IL-6 等水平增高，引起全身性慢性低度炎癥狀態(tài)［10］。研究證實(shí)T2DM 的發(fā)生發(fā)展受肥胖影響，胰島素抵抗是致病的中心環(huán)節(jié)［11］。IL-6 在肥胖患者中主要由脂肪細(xì)胞分泌，具有促炎活性并使炎癥反應(yīng)加重，降低胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起IR［12］。TNF-α誘導(dǎo)IR 機(jī)制有減弱胰島素引起的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、升高血漿游離脂肪酸水平、干擾胰島素信號(hào)傳遞、抑制產(chǎn)生瘦素和脂聯(lián)素，使胰島素信號(hào)通路受損等［13-14］，TNF-α與IR程度正相關(guān)［15］。郭展宏等［16］研究認(rèn)為肥胖狀態(tài)下炎癥因子、胰島素水平會(huì)增加，減重后FINS 水平、TNF-α和IL-6水平減低。喻松仁等［17］利用溫膽湯干預(yù)肥胖大鼠時(shí)證實(shí)控制體質(zhì)量的同時(shí)TNF-α、IL-6、IL-17 水平會(huì)降低（P＜0.01）。吳騰飛等［18］應(yīng)用苓桂術(shù)連湯治療肥胖伴IR，患者體質(zhì)量降低的同時(shí)TNF-α、IL-2炎癥因子降低，HOMA-IR下降。

中醫(yī)理論下的肥胖最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問(wèn)·奇病論篇》中有“喜食甘美而多肥”的記載，過(guò)食肥甘厚味是引起肥胖的因素。連陳湯以《太平惠民和劑局方》中二陳湯為基礎(chǔ)方加減而來(lái)，以健脾化濕，清熱滌痰為原則。方中君藥為半夏、黃連。半夏味辛能行散、性燥入脾胃，可消痰逐飲化痰濕；黃連燥濕化痰、除內(nèi)郁痰熱，可制約本方溫燥之性；同時(shí)半夏配黃連有疏理氣機(jī)、辛開(kāi)苦降之功；陳皮理氣健脾、燥濕化痰與茯苓健脾利濕使氣機(jī)得暢，有“治痰先治氣”之功；佐以健脾和中的甘草調(diào)和諸藥。本方配伍得當(dāng)，共奏健脾化濕功能，起改善體脂、減重抗炎的作用。

本研究表明，高脂喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.01），其血脂（TG、TC）、炎癥因子（TNF-α、IL-6）、FINS 水平以及HOMA-IR 都有升高趨勢(shì)；附睪脂肪組織的重量也高于空白組（P＜0.01）；HE 染色的附睪脂肪組織可觀察到脂肪脂滴增加、形態(tài)不均、數(shù)量減少。而連陳湯組小鼠體質(zhì)量下降（P＜0.01），血清TG含量降低（P＜0.01）、TC含量降低（P＜0.05）；TNF-α、IL-6、IL-1β水平及胰島素抵抗指數(shù)降低（P＜0.01）。說(shuō)明連陳湯可縮小脂肪細(xì)胞體積，增加脂肪細(xì)胞數(shù)量，降低脂滴含量?？梢?jiàn)連陳湯可以通過(guò)縮小脂肪累積、改善血脂紊亂、降低炎癥水平而改善IR。

研究表明連陳湯可改善肥胖患者中醫(yī)證候積分，改善或者臨床癥狀，降低體質(zhì)量、BMI、腰圍并降低血清TG、TC、LDL-C 水平，改善患者脂質(zhì)代謝紊亂［19］。連陳湯還可增加肥胖患者腸道菌群多樣性，降低厚壁菌門(mén)數(shù)量，升高擬桿菌門(mén)數(shù)目，這可能是連陳湯治療脾虛濕阻型肥胖的作用機(jī)制之一［20］。連陳湯可使TNF-α、Chemerin水平有下調(diào)趨勢(shì)可能是治療單純性肥胖的作用機(jī)制之一［21］。連陳湯可提高肥胖患者Omentin-1 水平、降低IL-6水平，改善FBG、FINS、HOMA-IR 水平，證實(shí)其可能通過(guò)降低血脂水平、減低慢性炎癥反應(yīng)改善IR［22］。