黃國(guó)玲，陳宗文，田秀英，陳紅兵

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院，重慶 404000

病毒性腦炎是一種較為常見(jiàn)的腦部感染疾病，多因急性病毒感染引起，多發(fā)于兒童時(shí)期。其癥狀多表現(xiàn)為體溫升高、嘔吐、頭部劇烈疼痛等，嚴(yán)重者伴有一定意識(shí)障礙，發(fā)病時(shí)易引起癲癇發(fā)作，并伴有一定的神經(jīng)元凋亡［1-2］，需盡早發(fā)現(xiàn)并給予治療，否則會(huì)造成死亡或不可逆后遺癥。病毒性腦炎患者腦脊液中S-100B 蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）含量較正常人偏高，因此該值變化對(duì)病毒性腦炎的診斷有重要價(jià)值，兩者常被用來(lái)作為評(píng)定腦損傷程度的指標(biāo)［3-4］。甘草甜素是一種純天然甜味劑，從甘草中提取，具有抗炎、抗氧化等作用，具有良好的臨床應(yīng)用潛力［5］，其抗炎、抗病毒作用能有效改善腦部水腫及炎癥反應(yīng)，降低血液中的S-100B蛋白和NSE 含量，甘草甜素還具備抑制神經(jīng)元凋亡的特性，從而改善神經(jīng)元活性［6］。因此，本研究通過(guò)建立病毒性腦炎小鼠模型，探究甘草甜素對(duì)病毒性小鼠神經(jīng)元活性及血清NSE水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只SD小鼠購(gòu)自同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2019-0007。健康雄性小鼠，鼠齡8 周左右，體質(zhì)量20 g 左右，室溫24 ℃左右，自由采食攝水，在無(wú)壓環(huán)境下30只小鼠適應(yīng)1周新環(huán)境。

1.2 試驗(yàn)儀器甲酚紫(上海源葉公司，批號(hào)：S19196)；S100B（上海酶聯(lián)公司，批號(hào)：mlE1584)；Bax、Caspase-3 抗體（上海恪敏科技公司，批號(hào)：ab5714、bs-0087R），ELISA試劑盒(上海羽哚公司，批號(hào)：YLY1150)；E100 型光學(xué)顯微鏡(武漢愛(ài)斯佩科學(xué)儀器有限公司)；TUNEL 試劑盒(北京裕恒豐公司，批號(hào)：8088)。

1.3 動(dòng)物模型建立及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為生理鹽水組、病毒性腦炎組和甘草甜素組。小鼠通過(guò)注射一定量的乙醚進(jìn)行麻醉（進(jìn)針點(diǎn)：右側(cè)眼角和耳根連線中點(diǎn)），生理鹽水組小鼠顱內(nèi)注射生理鹽水20 μL，病毒性腦炎組及甘草甜素組小鼠顱內(nèi)注射4.5×108pfu的柯薩奇病毒B3懸液20 μL，建立病毒性腦炎小鼠模型。甘草甜素組每天灌胃50 mg/kg 甘草甜素，生理鹽水組及病毒性腦炎組灌胃等劑量生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 小鼠行為能力 灌胃第1、7、14、21 天后，進(jìn)行Morris 水迷宮試驗(yàn)，讓小鼠在平臺(tái)中連續(xù)訓(xùn)練4 天，每組小鼠每天進(jìn)行2 次訓(xùn)練，記錄每組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間。

1.4.2 神經(jīng)元病理變化 甲酚紫（cresyl violet，CV）染色按常規(guī)焦油紫染色操作步驟進(jìn)行CV 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元病理學(xué)變化。

1.4.3 NSE 和S100B 檢測(cè) 經(jīng)枕骨大孔穿刺緩慢抽取各組小鼠腦脊液150 μL，加入少量生理鹽水，制作各組腦脊液標(biāo)本，按照試劑盒要求檢測(cè)星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）及NSE。

1.4.4 小鼠神經(jīng)元凋亡情況 取小鼠海馬組織石蠟切片，按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞陽(yáng)性著色為棕黃色，計(jì)算神經(jīng)元凋亡比例。

1.4.5 神經(jīng)元內(nèi)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法，用裂解液裂解各組神經(jīng)元，蛋白定量后行SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。Bax、Caspase-3一抗4 ℃過(guò)夜孵育后加入HPR標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，采用凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光成像，分析各組條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以xˉ±s表示，采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為能力3 組小鼠逃避潛伏期均隨灌胃天數(shù)的增加而減少，病毒性腦炎組逃避潛伏期長(zhǎng)于生理鹽水組（P＜0.05），甘草甜素組逃避潛伏期短于病毒性腦炎組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 小鼠逃避潛伏期 s

2.2 神經(jīng)元病理變化生理鹽水組小鼠海馬組織呈均勻一致的紫藍(lán)色，細(xì)胞密度大且排列規(guī)則，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)染色清晰，胞核淡染，未見(jiàn)明顯神經(jīng)元丟失；病毒性腦炎組小鼠海馬組織神經(jīng)元皺縮，體積縮小，胞體溶解，胞核固縮、深染，核溶解，細(xì)胞密度變小，排列散亂、無(wú)層次，神經(jīng)元丟失，具有凋亡特征；甘草甜素組小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷較病毒性腦炎組輕，細(xì)胞密度較大，排列較規(guī)則，形態(tài)較正常，核居中，核仁較清楚，可見(jiàn)斑點(diǎn)狀神經(jīng)元變性和壞死，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)元病理變化（CV，×200）

2.3 NSE 與S100B各組小鼠NSE 與S100B 均隨灌胃天數(shù)的增加而降低，病毒性腦炎組NSE 高于生理鹽水組（P＜0.05）；甘草甜素組低于病毒性腦炎組（P＜0.05）。見(jiàn)表2—3。

表2 各組小鼠NSE變化

表3 各組小鼠S100B變化

2.4 大鼠神經(jīng)元凋亡情況大腦皮層為細(xì)胞凋亡易發(fā)區(qū)，故本研究選取皮質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，與生理鹽水組小鼠神經(jīng)元凋亡率［（1.89±0.78）%］比較，病毒性腦炎組小鼠細(xì)胞凋亡率［（25.01±1.29）%］升高，甘草甜素組細(xì)胞凋亡率［（13.27±1.64）%］較病毒性腦炎組下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2—3。

圖2 各組小鼠神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL，×2400）

圖3 各組小鼠神經(jīng)元凋亡情況

2.5 神經(jīng)元內(nèi)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)生理鹽水組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)幾乎無(wú)Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)，甘草甜素組Bax、Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于病毒性腦炎組（P＜0.05），見(jiàn)圖4—5。

圖4 各組小鼠BAX、caspase-3蛋白表達(dá)情況

圖5 各組小鼠Bax、Caspase蛋白比較

3 討論

病毒性腦炎是一種常見(jiàn)的腦部疾病，一般由柯薩奇病毒所致，引起大腦血腦屏障異常，發(fā)生腦部水腫［7］，兒童為主要發(fā)病人群，起病急性或亞急性，臨床表現(xiàn)為惡心、全身無(wú)力等，病情較為嚴(yán)重者可能出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷［8-9］?？刂颇X水腫及顱內(nèi)高壓是相對(duì)有效的措施。NSE 是一種可溶性胞漿蛋白，主要分布于神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞漿中［10］。腦損傷后，神經(jīng)細(xì)胞胞膜受到破壞，NSE 從細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞間隙，最后進(jìn)入血液循環(huán)，使患者血液中NSE 水平升高［11］，升高幅度可作為腦損傷程度和范圍的評(píng)判。本研究通過(guò)注射柯薩奇病毒建立病毒性腦炎小鼠模型，探討甘草甜素對(duì)病毒性腦炎小鼠神經(jīng)元活性及血清NSE 的影響［12-14］。

NSE 是糖酵解過(guò)程中的催化水解酶，是一種可溶性胞漿蛋白質(zhì)，主要存在于神經(jīng)元、神經(jīng)纖維和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，與神經(jīng)元的分化、成熟有關(guān)。腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞受傷，其胞膜受到破壞，引發(fā)變性和崩解，對(duì)腦部產(chǎn)生傷害，神經(jīng)元受到損傷，隨后NSE 被釋放入腦脊液和血液中進(jìn)入血液循環(huán)，病毒性腦炎時(shí)患者血液中NSE 升高［15］，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生炎癥、水腫、壞死?；颊哐褐蠳SE 水平越高，則疾病嚴(yán)重程度越高，因此NSE 值通常作為評(píng)定病毒性腦炎引起腦部損傷的重要依據(jù)。本研究表明，甘草甜素能夠降低小鼠血液中NSE 值，其作用機(jī)制可能是因?yàn)楦什萏鹚厮猱a(chǎn)生的甘草次酸，可通過(guò)血腦屏障改善腦部水腫狀況，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低血液中NSE 值。甘草甜素對(duì)于因腦損傷導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力衰退也有一定療效，本研究表明病毒性腦炎組小鼠逃避潛伏期長(zhǎng)于生理鹽水組，甘草甜素組短于病毒性腦炎組。說(shuō)明甘草甜素可改善病毒性腦炎大鼠NSE值及小鼠學(xué)習(xí)能力。甘草甜素，別名甘草酸，可分解出葡萄糖醛酸和甘草次酸，甘草酸須通過(guò)甘草次酸及葡萄糖醛酸發(fā)揮作用，分為GL、GA 兩種吸收形式，甘草甜素具有一定抗病毒作用［14］。本研究表明，病毒性腦炎組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率高于生理鹽水組，而甘草甜素組低于病毒性腦炎組，說(shuō)明甘草甜素對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有一定抑制作用；有研究［16］表明，甘草甜素還具有一定免疫調(diào)節(jié)作用，其核心成分為苷元，能消除巨噬細(xì)胞活性，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。甘草甜素極性大，很難進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用，而其水解產(chǎn)生的甘草次酸可通過(guò)血腦屏障（星型細(xì)胞等組織）進(jìn)入其中發(fā)揮藥效。甘草甜素對(duì)腦損傷有作用，能改善腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)腦組織的保護(hù)作用機(jī)制主要表現(xiàn)為抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等方面。

本研究表明，病毒性腦炎組S100B 高于生理鹽水組，甘草甜素組低于病毒性腦炎組，其作用機(jī)制多為炎癥損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性增生，重建這種自身穩(wěn)定，在大、小膠質(zhì)細(xì)胞增生的同時(shí)伴有S100B蛋白濃度改變；S100B蛋白分子量為21KD，是S100 蛋白家族中的一員，主要由膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，廣泛分布于哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，影響神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育，正常條件下不能通過(guò)血腦屏障，半衰期2 h，經(jīng)腎臟清除，由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，在腦損傷時(shí)通過(guò)急性膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)增加其合成和分泌，參與損傷修復(fù)［17-18］。腦脊液S100B 蛋白濃度改變與病情相關(guān)，低濃度S100B 具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，高濃度伴隨一定的神經(jīng)毒性作用，并可參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞壞死后S100B 蛋白釋放和血腦屏障受破壞后通透性增高。有研究［19］表明，S100B 蛋白不僅反映神經(jīng)細(xì)胞損傷，還是腦組織損害后一種追蹤生化標(biāo)記物，對(duì)于疾病的診斷、病情變化監(jiān)測(cè)及療效的判定都具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)生理鹽水組幾乎無(wú)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，甘草甜素組Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)低于病毒性腦炎組。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序化死亡，多種疾病均有可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，由多種基因調(diào)控，常表現(xiàn)為生理性死亡。細(xì)胞發(fā)生凋亡有多種凋亡途徑，多數(shù)由Caspase 的活化啟動(dòng)。Caspase-3 效應(yīng)蛋白酶在凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也是凋亡發(fā)生的標(biāo)志［20］。Bax 為凋亡誘導(dǎo)蛋白，對(duì)凋亡有一定積極作用。當(dāng)Bax以二聚體形式存在時(shí)，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。甘草甜素能下調(diào)Caspase-3 表達(dá)，其原因是甘草甜素能降低GSK3β活性，活化的GSK3β作用于Caspase-3 分子，調(diào)控凋亡過(guò)程。這與本研究結(jié)果一致，因此甘草甜素可有效抑制細(xì)胞凋亡［20］。

綜上所述，甘草甜素對(duì)病毒性腦炎小鼠行為能力及神經(jīng)元活性改善有一定積極作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控NSE、S100B、Bax及Caspase-3水平有關(guān)。