王 斌，曾慶濤，王雅樂，黃 海，許 苗，吳紅彥

深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518000

生姜Acorus tatarinowii Schott，為天南星科屬干燥的根和莖。主產(chǎn)于四川、浙江、江蘇。秋冬二季采挖，除去須根及泥沙，《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］中，被列為上品，曬干，生用，“主風(fēng)寒濕痹，咳逆上氣，開心孔，補(bǔ)五臟，通九竅，明耳目，出音聲?！彼幮裕盒?、苦，溫。歸心、胃經(jīng)。功能：開竅豁痰，醒神益智等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，生姜具有改善記憶、認(rèn)知的功能［2］。因此，探究其改善記憶、認(rèn)知的機(jī)制，可更深層次挖掘其潛在的藥用價(jià)值。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種慢性、進(jìn)行性、衰退性不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)性系統(tǒng)疾病［3］，主要表現(xiàn)為認(rèn)知、記憶力下降等癥狀，全球大約有5000 萬老年人因AD 生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響［4］。據(jù)報(bào)道全球癡呆癥經(jīng)濟(jì)成本，包括直接醫(yī)療、直接社會(huì)部門和非正規(guī)醫(yī)療費(fèi)用預(yù)計(jì)到2030年將增至2萬億美元［5］。

AD發(fā)病機(jī)制尚未闡明，1992年哈代和希金斯［6］首次提出了淀粉樣級聯(lián)假說的病因β-淀粉樣蛋白。目前認(rèn)為，β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）的沉積與Tau 蛋白過度磷酸化有一定關(guān)聯(lián)，包括炎癥、免疫、神經(jīng)元死亡和特異性神經(jīng)遞質(zhì)減少等相關(guān)病理過程［7］。近年來，藥物治療主要以膽堿酯酶抑制劑為主［8］，但效果不理想。因此，探尋高效低毒藥物已成為AD領(lǐng)域亟需解決的熱點(diǎn)問題之一［9］。

英國藥理學(xué)家Hopkins 2007 年提出的“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”，以系統(tǒng)生物學(xué)、基因組學(xué)、藥理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等為基礎(chǔ)［10］?？蓮姆肿?、生物、基因網(wǎng)絡(luò)角度系統(tǒng)地、全方位、多層次地揭示中藥治療疾病的機(jī)制［11］。本研究通過構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-AD 網(wǎng)絡(luò)圖，較直觀呈現(xiàn)出藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)行相關(guān)系統(tǒng)分析［12］，旨在更深層次探究生姜防治AD的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生姜活性成分及作用靶點(diǎn)獲取和篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［13］，檢索“生姜”活性成分，并參考已報(bào)道文獻(xiàn)［14］，設(shè)置篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選生姜主要活性成分，并從知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫加以補(bǔ)充。運(yùn)用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）［15］和數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），設(shè)置物種為“人類”，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)基因名稱。

1.2 AD 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）、人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database，GeneCards）等檢索AD靶點(diǎn)，以“Alzheimer's Disease”為關(guān)鍵詞，獲得AD 基因，整理剔除重復(fù)基因，收集AD 靶點(diǎn)。通過R 軟件將生姜活性成分和AD 靶點(diǎn)取交集，得到生姜治療AD的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.3 藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運(yùn)用Cytoscape［16］軟件（http：//www.cytoscape.org）中的插件“network analyzer”，對分子-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)進(jìn)行分析［17］，圖中節(jié)點(diǎn)（Node）代表藥物與靶點(diǎn)；邊（Edge）代表藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的關(guān)聯(lián)。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interactions，PPI)構(gòu)建將生姜治療AD 的潛在靶點(diǎn)輸入STRING（https：//string-db.org）［18］中，限定物種為“Homo Sapiens”，獲取靶點(diǎn)，設(shè)置最低閾值，設(shè)為“medium confidence”，隱藏散在游離靶點(diǎn)，其他參數(shù)值設(shè)定為默認(rèn)值，以txt文件保存，得到蛋白間網(wǎng)絡(luò)模型。運(yùn)用Network Analyzer獲得中介度（betweenness centrality）和連接度（degree）等參數(shù)對模型進(jìn)行預(yù)測分析［19］。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析運(yùn)用Bioconductor生物包，通過R軟件，安裝相關(guān)生物包，便于分析GO 功能。ClusterProfiler 包是R 軟件基因數(shù)據(jù)分析包之一，可搜索Bioconductor 提供的GO功能和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，其可視化功能特點(diǎn)突出。運(yùn)用該軟件，以P＜0.05 為篩選條件，并將得到的結(jié)果可視化處理［20］。

2 結(jié)果

2.1 生姜活性成分及作用靶點(diǎn)通過TCMSP 篩選到生姜活性成分105個(gè)，潛在活性成分5個(gè)。見表1。

表1 生姜活性成分

2.2 生姜活性成分治療AD的潛在作用靶點(diǎn)共得到AD與藥物共同靶點(diǎn)60個(gè)，見圖1。

圖1 藥物與AD靶點(diǎn)交集圖

2.3 藥物-靶點(diǎn)-AD 網(wǎng)絡(luò)藥物主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系共33 個(gè)。通過Degree和BC 值大小，篩選核心靶點(diǎn)［21］，結(jié)果IL-6、Akt1、JUN、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT 等靶點(diǎn)是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，揭示這些節(jié)點(diǎn)可能是生姜治療AD 的有效成分或靶點(diǎn)。見圖2、表2。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

表2 藥物-靶點(diǎn)-AD網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)特征

2.4 生姜治療AD關(guān)鍵靶點(diǎn)登陸STRING，導(dǎo)入生姜治療AD的靶點(diǎn)，將篩選條件設(shè)置為＞0.9，將單個(gè)游離的蛋白隱藏，得到PPI 圖。節(jié)點(diǎn)（node）共60個(gè)，平均值12.9，邊（edge）388 條。邊數(shù)（edge）越多，表示該節(jié)點(diǎn)（node）對應(yīng)的靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要［22］。通過R 軟件，收集靶點(diǎn)信息條形圖，結(jié)果Akt1、MAPK8、GASP3、PTGS2、CAT、IL-6、JUN 等蛋白度值較高，表明該蛋白作用顯著，也是其他蛋白互通的紐帶。見圖3—4。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息條形圖

2.5 GO 功能及KEGG 通路分析GO 揭示，生姜治療AD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)排名前10 的生物學(xué)功能主要包括肽結(jié)合（12 個(gè)靶點(diǎn)）、酰胺結(jié)合（12 個(gè)靶點(diǎn)）、核受體活性（8 個(gè)靶點(diǎn)）、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性（8個(gè)靶點(diǎn)）、血紅素結(jié)合（8 個(gè)靶點(diǎn)）、四吡咯結(jié)合（8個(gè)靶點(diǎn)）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（8 個(gè)靶點(diǎn)）、RNA聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（7 個(gè)靶點(diǎn)）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（6 個(gè)靶點(diǎn)）等，顯示生姜可通過調(diào)控多個(gè)復(fù)雜的生物信息學(xué)、基因組學(xué)以及抑制轉(zhuǎn)錄進(jìn)程來治療AD。通過KEGG 分析獲得135 個(gè)通路，以P＜0.05 設(shè)置篩選條件，對核心KEGG進(jìn)行分析，獲得5條主要信號(hào)通路，主要集中在AGE/RAGE（13個(gè)靶點(diǎn)）、TNF（12個(gè)靶點(diǎn)）、IL-17（9 個(gè)靶點(diǎn)）、C-type lectin receptor（10 個(gè)靶點(diǎn)）、Toll 樣受體（9 個(gè)靶點(diǎn)）等信號(hào)通路上。見圖5—6。

圖 6 KEGG富集分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，beta-sitosterol、6-methylgin gediacetate 2、Stigmasterol、poriferast-5-en-3beta-ol、Dihy-drocapsaicin等為生姜主要活性成分。beta-sitosterol（β-谷甾醇）可降低逆轉(zhuǎn)APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元興奮性突觸后電流頻率，表明β-谷甾醇可改善記憶、學(xué)習(xí)障礙及運(yùn)動(dòng)障礙，同時(shí)可能降低Aβ沉積［23］。有研究［24］發(fā)現(xiàn)Dihydrocapsaicin 可減少AD 活性氧和炎癥，提示辣椒素可通過調(diào)節(jié)活性氧和炎癥對APP的額外和潛在不良影響加工與加工β穩(wěn)態(tài)，在體內(nèi)對AD起防治作用。

活性氧介導(dǎo)的氧化修飾Akt1 有助于突觸AD的功能障礙，視為失去對突觸可塑性至關(guān)重要的活性依賴性蛋白質(zhì)翻譯和維護(hù)，而促進(jìn)突觸上Akt1-mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)的治療策略可能提供新的治療方法，成為抗氧化酶疾病的治療靶點(diǎn)［25］。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）又稱為活化蛋白激酶，MAPK8 是MAPK 家族成員之一，又被稱為c-Jun 氨基末端激酶1（c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1），通過磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子以進(jìn)一步激活相應(yīng)子蛋白1（activator protein-1，AP-1），促使下游相關(guān)基因表達(dá)，在細(xì)胞（分化、增殖、生存、死亡）、炎癥等病理發(fā)生、發(fā)展過程中起調(diào)控作用［26］。CASP3 又稱為半胱氨酸蛋白，是Caspase 蛋白家族中的成員之一，一般情況下是以非活化酶原形式存在，Caspase-3 一旦激活，將會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如阿爾茨海默病、腦膜炎等［27］。

KEGG揭示，IL-17通路與炎癥的發(fā)生關(guān)系密切，IL-17 為受體家族，主要由IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC 等組成，研究發(fā)現(xiàn)AD 患者體內(nèi)IL-17 表達(dá)升高［28］。Toll 通路又稱為（Toll-like receptors，TLR）TLR，是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類比較重要的蛋白質(zhì)分子之一，同時(shí)也是連接特異性免疫和非特異性免疫的橋梁，研究發(fā)現(xiàn)［29］Aβ可激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，將免疫監(jiān)視模式轉(zhuǎn)化為免疫應(yīng)答模式，使產(chǎn)生的IL-6、TNF-α及其他神經(jīng)毒性因子，阻斷Toll信號(hào)通路，減少了相關(guān)促炎因子的產(chǎn)生。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究生姜治療AD的作用機(jī)制［30］，結(jié)果顯示涉及多個(gè)活性成分、靶標(biāo)及多個(gè)相關(guān)通路［31］，與中藥治療AD 多靶點(diǎn)特點(diǎn)切合［32］，可為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理機(jī)制研究提供新思路、新方法［33］。