賴(lài)紅芳，潘立衛(wèi)，韋雪梅，覃國(guó)樂(lè)，黃秀香

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州 546300）

構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera）是一種?？坡淙~喬木，雌雄異株，又叫楮樹(shù)，含有豐富的蛋白質(zhì)和多種微量元素，是一種優(yōu)質(zhì)的畜禽飼料資源（龔利福等，2021 ；彭皓等，2019）。由于構(gòu)樹(shù)葉中的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，直接讓畜禽食用新鮮的構(gòu)樹(shù)葉，蛋白質(zhì)不易被畜禽吸收（陶興無(wú)，2005），因此，對(duì)構(gòu)樹(shù)葉進(jìn)行發(fā)酵處理可以有效提高豬、雞等畜禽對(duì)構(gòu)樹(shù)飼料中蛋白質(zhì)的利用率和動(dòng)物機(jī)體的免疫機(jī)能和抗病能力，且對(duì)肉蛋白質(zhì)有所改善（夏敏等，2020 ；蔡玉等，2019 ；邳植等，2018）。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，因此，測(cè)定氨基酸的含量及構(gòu)成可以了解蛋白質(zhì)生物效價(jià)，也是評(píng)價(jià)動(dòng)物飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)。檢測(cè)氨基酸的方法有分光光度計(jì)法（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2019）、液相色譜- 質(zhì)譜串聯(lián)法（郭尚偉等，2016）、氣相色譜法（Roessner 等，2000），氨基酸自動(dòng)分析法（張?zhí)K平等，2017）和高效液相色譜法（劉成模等，2022）。分光光度計(jì)法操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)種類(lèi)單一，且無(wú)法對(duì)氨基酸進(jìn)行分離；氨基酸自動(dòng)分析儀價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，不適合廣泛運(yùn)用（張椿翊等，2022）；高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸操作簡(jiǎn)單、樣品用量少、選擇性好、分離效率高（魏姜勉，2021），且采用柱前衍生具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)（歐陽(yáng)道福，2018），因此，本研究采用酸水解法來(lái)提取發(fā)酵構(gòu)樹(shù)飼料中的氨基酸，并對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生- 高效液相色譜檢測(cè)構(gòu)樹(shù)飼料中的氨基酸方法，為構(gòu)樹(shù)飼料中氨基酸含量的分析檢測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 飼料：雜交構(gòu)樹(shù)飼料、野生構(gòu)樹(shù)飼料（發(fā)酵的時(shí)間為2021 年10 月29 日），由河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院覃國(guó)樂(lè)教授提供。

18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：Solarbio，乙腈、甲醇（色譜純），鹽酸、氫氧化鈉磷酸氫二鈉、無(wú)水乙酸鈉、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸、苯酚、冰乙酸均為分析純。

1.1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Agilent 8453 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；FE 28 酸度計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的水解 將構(gòu)樹(shù)飼料烘干、粉碎、過(guò)篩，除去油脂和色素，烘干、備用。按文獻(xiàn)（木合布力阿布力孜等，2011）對(duì)樣品進(jìn)行水解后離心，吸取上清液1.0 mL 水浴蒸干，殘?jiān)?.0 mL 0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解，過(guò)無(wú)機(jī)膜（0.45 μm）后保存，備用。

1.2.2 氨基酸的衍生方法 移取75 μL 的氨基酸水解液，依次加入300 μL（pH = 9.0）的緩沖鹽溶液、150 μL 的OPA 衍生劑溶液、75 μL 10%的冰乙酸溶液（調(diào)節(jié)pH值至中性）、900 μL純水，定容到1.5 mL，衍生5 min 后排氣泡，過(guò)有機(jī)膜（0.45 μm），待上機(jī)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.05 g 于小燒杯中，用0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解并定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，得到濃度為1.0 g/L 的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按文獻(xiàn)（淳澤利等，2019）操作，按1.2.2 的方法進(jìn)行衍生，取1μL 衍生液在1.2.4 條件下測(cè)試。以峰面積為Y軸，氨基酸的質(zhì)量濃度為X軸，得出各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 色譜分析條件 色譜柱：Advance Bio AAA 反相色譜柱（4.6×100 mm，2.7μL）；流動(dòng)相A 為10 mmol Na2HPO4，pH=8.2（±0.2）；流動(dòng)相B 為乙腈-甲醇-純水（體積比為45：45：10）；流速0.8 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量：1μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm；流動(dòng)相洗脫梯度如表1 所示。

表1 洗脫梯度程序

1.2.5 飼料中氨基酸水解條件的優(yōu)化 采取單因素試驗(yàn)，以氨基酸峰面積的大小為主要參考對(duì)象，對(duì)氮?dú)猓ㄍㄈ?、不通入）、水解溫度?0、90、100、110、120 ℃）、水解時(shí)間（10、15、20、24、26 h）、水解液濃度（4、5、6、7、8 mol/L 的HCl 溶液）4 個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，研究不同條件對(duì)飼料中氨基酸水解的影響，篩選出符合飼料中氨基酸水解的最佳條件。

2 結(jié)果

2.1 飼料中氨基酸水解條件的優(yōu)化

2.1.1 氮?dú)鈱?duì)飼料中氨基酸水解的影響 由圖1可知，通入氮?dú)馑獾男Ч葲](méi)有通入氮?dú)馑夂?，因?yàn)榈獨(dú)馐嵌栊詺怏w，水解時(shí)可以避免氨基酸在高溫時(shí)被氧化，起到保護(hù)作用。

圖1 通入氮?dú)鈱?duì)飼料中氨基酸吸收峰面積的影響

2.1.2 HCl 濃度對(duì)飼料中氨基酸水解的影響 由圖2 可知，隨著HCl 溶液濃度的增大，氨基酸的峰面積也隨之增加；當(dāng)HCl 溶液濃度為6 mol/L，氨基酸的峰面積達(dá)到最大值，但當(dāng)濃度繼續(xù)增大，氨基酸的峰面積均呈下降趨勢(shì)。因?yàn)镠Cl 濃度過(guò)低時(shí)，達(dá)不到蛋白質(zhì)水解的酸度要求，過(guò)高時(shí)，部分氨基酸會(huì)被破壞。

圖2 HCl 濃度對(duì)飼料中氨基酸的吸收峰面積的影響

2.1.3 水解溫度對(duì)飼料中氨基酸水解的影響 由圖3 可知，隨著水解溫度升高，各氨基酸的峰面積也逐漸升高，在110℃達(dá)到最大值，但溫度繼續(xù)升溫，氨基酸的峰面積呈下降趨勢(shì)。溫度過(guò)低時(shí)水解速率慢；溫度過(guò)高時(shí)氨基酸會(huì)發(fā)生脫氨和脫羧等反應(yīng)。

圖3 水解溫度對(duì)飼料氨基酸的吸收峰面積的影響

2.1.4 水解時(shí)間對(duì)飼料中氨基酸水解的影響 如圖4 所示，隨著水解時(shí)間的增加，氨基酸的峰面積呈上升趨勢(shì)，但水解了24 h 后氨基酸的峰面積開(kāi)始降低，說(shuō)明24 h 水解基本完成，再增加時(shí)間反而使氨基酸分解或被氧化。

圖4 水解時(shí)間對(duì)氨基酸峰面積的影響

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，水解的最優(yōu)條件為：通入氮?dú)庾鞅Ｗo(hù)氣，6 mol/L 的HCl 溶液作為水解液，水解時(shí)間為24 h，水解溫度為110℃。

2.2 系統(tǒng)適用性 取衍生化后的標(biāo)準(zhǔn)品液和樣品液1μL，按照“1.2.4”中的儀器方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，衍生化后的18 種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜峰中除了甘氨酸和蘇氨酸不能分開(kāi)外，其余的16 氨基酸峰形尖銳，分離度良好，如下圖所示。可用于飼料中氨基酸含量的測(cè)定。

圖5-1 18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5-2 野生構(gòu)樹(shù)飼料所含氨基酸的色譜圖

圖5-3 雜交構(gòu)樹(shù)飼料所含氨基酸的色譜圖

2.3 線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限由表2 可知，按1.2.3 操作后，以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程及氨基酸的檢出限。結(jié)果表明，16 種氨基酸的相關(guān)系數(shù)為0.9991 ～0.9999。

表2 試驗(yàn)方法的線(xiàn)性范圍和檢出限

2.3 精密度試驗(yàn) 移取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液75μL，按1.2.2 衍生方法進(jìn)行衍生，按1.2.4 方法平行測(cè)定5 次，以這5 次測(cè)出來(lái)的峰面積來(lái)考察儀器的精密度，5 次測(cè)定結(jié)果的RSD 值為0.74% ～3.57%（n=5）。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取3 份雜交構(gòu)樹(shù)飼料樣品，按照1.2.1 和1.2.2 的方法進(jìn)行操作，再按1.2.4 方法測(cè)定，記錄16 種氨基酸的峰面積，結(jié)果顯示，16 種氨基酸峰面積對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.44% ～3.76%。

2.5 構(gòu)樹(shù)飼料中氨基酸的含量測(cè)定與結(jié)果分析構(gòu)樹(shù)飼料按1.2.1 和1.2. 2 進(jìn)行操作后（n=3），按1.2.4 方法測(cè)定，結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，雜交構(gòu)樹(shù)飼料檢測(cè)出15 種氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 種，占總氨基酸的36.22%，含量從多到少的排序?yàn)榱涟彼幔颈奖彼幔纠i氨酸＞賴(lài)氨酸＞異亮氨酸。野生構(gòu)樹(shù)飼料檢測(cè)出14 種氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 種，占總氨基酸的34.74%，含量從多到少的排序?yàn)榱涟彼幔纠i氨酸＞賴(lài)氨酸＞苯丙氨酸＞異亮氨酸。

表3 樣品中氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取雜交構(gòu)樹(shù)飼料樣品3 份，加入同一水平的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，按照1.2.1 和1.2.2 方法操作，再按1.2.4 方法測(cè)定，考察方法的回收率。得到平均回收率為90.5% ～107.8%。

3 討論

鄰苯二甲醛（OPA）作為衍生劑，氨基酸的衍生時(shí)間短，只需5 min，縮短了氨基酸的分析檢測(cè)時(shí)間（齊麟等，2022），而且氨基酸的分離效果較好，峰型好看、不拖尾，準(zhǔn)確度和精密度較好，能滿(mǎn)足構(gòu)樹(shù)飼料的氨基酸含量測(cè)定需要。

由表3 可知，雜交構(gòu)樹(shù)飼料的總氨基酸比野生構(gòu)樹(shù)飼料的高，這可能是雜交構(gòu)樹(shù)通過(guò)雜交育種后，在人工種植過(guò)程比野生構(gòu)樹(shù)生長(zhǎng)的環(huán)境好（曹力凡等，2021 ；郭琪等，2020）。雜交構(gòu)樹(shù)飼料的總氨基酸為8.53 g/100 g ；野生構(gòu)樹(shù)飼料的總氨基酸含量為7.11 g/100 g ；與玉米飼料的總氨基酸（8.1 g/100 g）相差不大（尤曉蒙，2015），可以考慮用構(gòu)樹(shù)飼料取代玉米，減少成本，緩解蛋白質(zhì)飼料不足的問(wèn)題（陳景來(lái)，2022）。為養(yǎng)殖戶(hù)在選擇飼料上提供一定的參考價(jià)值，也為構(gòu)樹(shù)飼料的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

采用柱前衍生- 高效液相色譜法對(duì)構(gòu)樹(shù)飼料中的氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，構(gòu)樹(shù)飼料中16種氨基酸的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回收率為90.5% ～107.8%。構(gòu)樹(shù)飼料的氨基酸種類(lèi)豐富，總氨基酸含量高，因此，氨基酸可作為評(píng)價(jià)構(gòu)樹(shù)飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。