張興民 池小娜 顧文媛 邵 揚 王玉萍*

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅蘭州 730000；2 甘肅省臨夏回族自治州農(nóng)業(yè)科學院，甘肅臨夏 731100）

蠶豆（ViciafabaL.，2n= 12），又名胡豆、羅漢豆等，為豆科（Leguminosae）巢菜屬（Vicia）一年生或越年生草本植物，主要分布在歐洲、亞洲和北美洲，是世界第六大食用豆類作物（袁璟亞 等，2022）。據(jù)FAO 資料統(tǒng)計，2019 年全球蠶豆種植面積257.72 萬hm2，總產(chǎn)量543.15 萬t；中國種植面積83.96 萬hm2，總產(chǎn)量174.09 萬t，均居世界第一（王晨瑜，2021）。我國的西北、西南和江浙地區(qū)是春蠶豆和秋蠶豆主產(chǎn)區(qū)，長江以北地區(qū)為春播區(qū)，以南為秋播區(qū)（周瑤 等，2022）。蠶豆為常異花授粉植物，自然異交率為5%～20%，雜合度高，種群內(nèi)的分類比較困難且分類體系雜亂（王海飛和宗緒曉，2011）。迄今為止，蠶豆與屬內(nèi)野生種的種間雜交及轉基因育種鮮見獲得成功的報道，遺傳變異主要來自于自然變異或者基因突變（包世英，2016）。我國蠶豆栽培歷史悠久，在長期的進化和演化過程中，形成了豐富的種質資源，目前已收集并保存在種質庫中的蠶豆資源逾5 200 份，其中，65%為國內(nèi)種質資源，其余為國外引進資源（包世英，2016）。不同地理來源和用途的種質資源，在生育期、株高、開花習性、分枝數(shù)、花色、籽粒大小、粒色、種皮顏色、莢長、莢寬、莢粒數(shù)、單株莢數(shù)、百粒重、抗病性和品質等形態(tài)特征和生物學特性上形成明顯差異，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性（宗緒曉，2006），可以為蠶豆品種的遺傳改良提供重要資源。長期以來，蠶豆種質資源評價主要采用傳統(tǒng)的田間鑒定，即以植株表型為基礎，這種方法易被育種家接受，但是也易受環(huán)境條件及栽培措施的影響，結果缺乏準確性。隨著登記品種的逐漸增多，品種間的相似度越來越大，僅通過傳統(tǒng)的田間表型鑒定往往難以區(qū)分。利用分子標記比較各品種（材料）之間的差異，分析遺傳背景，判斷親緣關系并進行分類，為種質資源的遺傳多樣性分析和科學配制育種組合提供了新方向。Jayakodi 等（2023）成功測序并組裝了第1 個高質量的蠶豆參考基因組（約13 Gb），對于新型分子標記開發(fā)及蠶豆分子遺傳學研究奠定了理論基礎。本文分析了分子標記的類型、發(fā)展及其在蠶豆遺傳育種方面的研究進展，并探討了其發(fā)展前景，以期為蠶豆遺傳育種和種質資源開發(fā)利用提供參考。

1 分子標記的類型及發(fā)展

隨著高通量測序技術的進步，DNA 分子標記已經(jīng)發(fā)展到第3 代（陳星和高子厚，2019）。最初是基于DNA-DNA 雜交的低通量分子標記技術，包含限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性（variable number tandem repeats，VNTR）、染色體原位雜交（chromosome in situ hybridization，CISH）等。這類分子標記多態(tài)性程度低，對DNA質量要求高，難以用于大規(guī)模育種實踐（王明湖等，2017）。第2 代分子標記技術可分為兩種類型：一類是基于PCR 技術的分子標記技術，含隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、簡單重復序列間擴增（intersimple sequence repeat，ISSR）、 簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、相關序列擴增多態(tài) 性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、 特定序列擴增（sequence characterized amplified regions，SCAR）以及靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）等。另一類為PCR 與限制性酶切結合的分子標記技術，含擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和酶切擴增多態(tài)序列（cleaved amplified polymorphism sequence-tagged sites，CAPS）等。第2 代分子標記技術的多態(tài)性較第1 代高，需要的DNA 量較少（梁帥，2021）。第3 代分子標記技術是以高通量測序和DNA 芯片技術為核心的分子標記技術，包括單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、DNA條形碼技術（DNA barcode）、插入/缺失多態(tài)性（insertion-deletion，InDel）、單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、 競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）。第3 代分子標記分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好且多態(tài)性豐富，兼具高通量和自動化檢測（Hechanova et al.，2021）。

2 分子標記在蠶豆遺傳育種中的應用

2.1 遺傳連鎖圖譜構建

農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質性狀大多數(shù)是多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳連鎖圖譜在數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）的遺傳鑒定中起關鍵作用（劉程宏 等，2021）。在早期，蠶豆遺傳連鎖圖譜的構建主要采用形態(tài)標記和同工酶標記方法，后來采用DNA 分子標記法，但是標記在基因組中的分布密度低，定位到的QTL 由于精度有限無法開展精細定位和克隆。因此，整合不同類型的標記構建蠶豆高密度飽和遺傳連鎖圖譜的研究大量開展。自從Vande 等（1991）采用形態(tài)標記、同工酶、RFLP 和RAPD 標記構建了首張蠶豆遺傳連鎖圖譜（連鎖群7 個，總長度231.40 cM）以來，表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）、SSR、EST-SSR 和SNP 標記的不斷發(fā)展豐富了蠶豆遺傳連鎖圖譜的研究。Pozarkova 等（2002）從蠶豆特異性DNA 文庫中開發(fā)了位于1 號染色體上的SSR標記。Roman 等（2004）將1 號染色體上開發(fā)的SSR 標記用于構建遺傳連鎖圖譜。Ma 等（2013）構建了首張完全利用SSR 標記的蠶豆遺傳連鎖圖譜，包含15 個連鎖群和128 個SSR 標記。Yang等（2019）對此圖譜進行了標記加密，構建了包含7 個連鎖群、465 個SSR 標記的新遺傳連鎖圖譜，總長度在原圖譜基礎上增加了2 928.45 cM，平均遺傳距離縮短了2.79 cM。Satovic 等（2013）報道了第1 個蠶豆參考共識遺傳連鎖圖譜，覆蓋了4 062 cM 的遺傳長度，含6 個主要連鎖群。Kaur等（2014）構建了第1 張完全基于SNP 的蠶豆通用連鎖圖譜，總長度為1 216.8 cM，覆蓋12 個連鎖群，平均標記間距為2.3 cM。Carrillo-Perdomo等（2020）利用3 個作圖群體構建了高飽和度遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含1 728 個SNP 標記，分布于6 個連鎖群。Sudheesh 等（2019）構建的整合圖譜是目前蠶豆中飽和度最高的遺傳連鎖圖譜。該圖譜包含1 850 個SNP 標記，分布于6 個連鎖群上，總長度為1 439 cM，平均遺傳距離為0.8 cM。迄今為止，國內(nèi)外研究者利用12 種遺傳標記共構建了24 個蠶豆遺傳連鎖圖譜（周仙莉 等，2021）。蠶豆遺傳連鎖圖譜的飽和度不斷增加，為重要農(nóng)藝性狀相關基因的精確定位奠定了基礎（張紅巖，2018）。

2.2 分子標記輔助育種

蠶豆傳統(tǒng)育種以系統(tǒng)選育和雜交選育為主（杜敏敏 等，2017），利用分子標記輔助選擇可以從DNA 水平對目標性狀的基因型直接選擇，大大提高育種效率（Gnanasambandam et al.，2012；楊夢婷 等，2019）。Avila 等（2006）采用候選基因法開發(fā)了首個適合蠶豆生長習性選擇的CAPS 標記。Khazaei 等（2017）開發(fā)了1 個與蠶豆嘧啶葡糖苷及伴蠶豆嘧啶核苷含量相關基因緊密連鎖的KASP 標記，為培育低抗營養(yǎng)因子的蠶豆品種奠定了基礎。非生物脅迫是限制蠶豆產(chǎn)量的主要因素（Khazaei et al.，2021），利用分子標記輔助選擇法選育抗逆性強的蠶豆品種有較多報道（Maalouf et al.，2019）。Ali 等（2016）利用SNP 和AFLP 對蠶豆的耐旱和抗凍性進行了關聯(lián)分析，為選育耐旱抗凍性蠶豆新品種奠定了基礎。國內(nèi)蠶豆分子標記的研究開展較晚，田瑩瑩（2018）利用蠶豆品種云122 和TF42 作親本雜交形成的F2群體構建遺傳連鎖圖譜，定位到與蠶豆籽粒性狀連鎖的分子標記，為籽粒性狀的遺傳改良提供了基礎。劉玉玲等（2022a）利用132 對SSR 標記對260 份蠶豆資源的遺傳多樣性進行分析，檢測到與淀粉含量極顯著關聯(lián)的8 個標記。辛佳佳等（2022）結合22 個主要農(nóng)藝性狀與8 個SSR 標記對57 份江西蠶豆材料進行遺傳多樣性分析，篩選出了4 份優(yōu)質資源。劉玉玲等（2022b）利用76 個SSR 標記對321 份蠶豆種質資源進行基因分型，發(fā)現(xiàn)與17 個主要農(nóng)藝性狀相關聯(lián)的SSR 位點389 個，其中優(yōu)異等位變異7 個，并篩選了7 份優(yōu)異資源。

2.3 遺傳多樣性分析

種質資源的遺傳變異豐富度是品種改良及基因資源發(fā)掘與利用的基礎（Abid et al.，2015）。研究初期主要采用農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)確定遺傳變異度，隨著測序技術的發(fā)展，分子標記被應用到蠶豆遺傳多樣性分析中。Link 等（1995）利用RAPD標記對3 組蠶豆自交系（13 個歐洲小種子系、6 個歐洲大種子系和9 個地中海系）資源進行分類和雜種優(yōu)勢群鑒定。Kwon 等（2010）利用TRAP 標記檢測151 份從國內(nèi)外收集到的蠶豆資源，發(fā)現(xiàn)地方品種異交率高，存在較大的變異。Alghamdi 等（2012）首次采用SRAP 標記對58 個蠶豆基因型之間的遺傳關系和遺傳多樣性進行分析，結果顯示地方品種依據(jù)其起源進行聚類，而其他品種則根據(jù)種子類型進行分簇。侯萬偉和張小娟（2021）利用SRAP 標記分析12 份蠶豆材料，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的資源存在較大差異，即使來自相同地區(qū)的資源親緣關系也較遠，存在豐富的遺傳多樣性。Ouji等（2012）利用特異序列擴增多態(tài)性（sequencespecific amplification polymorphism，SSAP）標記檢測9 個突尼斯蠶豆種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)當?shù)刂髟孕Q豆Batata 種群與其他8 個種群區(qū)別明顯。Zong 等（2009）采用AFLP 標記比較204 份國內(nèi)和39 份國外秋蠶豆種質材料，發(fā)現(xiàn)這些資源分屬兩個基因庫，中國秋蠶豆資源單獨形成1 個基因庫，其他地區(qū)來源的蠶豆資源形成另一個基因庫，而云南蠶豆資源與我國其他省份秋蠶豆資源又有明顯區(qū)別。Zong 等（2010）又利用AFLP 標記分析39 份國內(nèi)和136 份國外春蠶豆材料，將這些資源分為4 個基因庫，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外春蠶豆資源區(qū)別明顯，遺傳多樣性與來源地的生態(tài)環(huán)境有關。Gol等（2017）利用32 對SSR 引物將255 份蠶豆種質資源分為兩個亞群，發(fā)現(xiàn)地方品種和栽培品種的遺傳多樣性沒有顯著差異。Neda 等（2021）利用ISSR 標記對96 份來自埃塞俄比亞不同地區(qū)的蠶豆資源進行分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)來源的資源在大部分組群中均有分布，均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。Mulugeta 等（2021）利用SNP 標記發(fā)現(xiàn)48 份來自于埃塞俄比亞的蠶豆種質資源存在較高的遺傳多樣性。

2.4 基因定位

通過分子標記定位并發(fā)掘生物脅迫抗性相關基因，促進了蠶豆抗性種質資源創(chuàng)新及抗病新品種培育。銹病、赤斑病、枯萎病、根腐病和褐斑病等嚴重影響蠶豆產(chǎn)量和品質，選育抗性品種是防控病害最直接的方法（李仁慧 等，2019）。Avila 等（2003）通過混合分組分析法，在抗性品系2N52和易感品系VF-176 雜交產(chǎn)生的F2群體中檢測到3 個與抗銹病基因Uvf-1緊密連鎖的RAPD 標記（OPD13736、OPI20900和OPL181032）。Ocaa-Moral等（2017）利用SNP 標記發(fā)現(xiàn)蠶豆2 號（Af2）、3 號（Af3）和6 號染色體中的3 個區(qū)域與枯萎病抗性相關。Faridi 等（2021）通過對秋蠶豆種質材料的關聯(lián)作圖分析，開發(fā)出12 個與枯萎病抗性相關的分子標記。Roman 等（2003）通過構建蠶豆遺傳分離群體及QTL 分析，將與抗褐斑病的兩個相關基因區(qū)段（Af1和Af2）分別定位在第3 號和第2 號染色體。蠶豆子葉顏色和單寧含量是評價蠶豆品質的重要指標，發(fā)掘并定位與這些性狀緊密關聯(lián)的基因，可以為改善蠶豆品質提供理論基礎。Gutierrez 等（2007，2008）開發(fā)出蠶豆中與單寧缺失基因（zt-1、zt-2）緊密連鎖的2 個SCAR 標記（SCC5551和SCAD16589）。Hou 等（2018）檢測出1 個與單寧缺失基因zt-1緊密連鎖的SSR 標記（SSR84）。Zanotto 等（2020）利用176 個Disco/2 ×ilb938/2 雜交F6重組自交系在蠶豆3 號染色體上檢測出1 個與單寧缺失基因zt2相關的SNP 位點（Vf_Mt7g100500_001），并利用該位點開發(fā)出1個KASP 標記。沙偉超（2017）基于黃綠子葉蠶豆雜交構建的F2遺傳群體，利用混和分組分析法鑒定到9 個與子葉顏色緊密連鎖的SSR 標記，并將控制子葉顏色的基因初步定位在LG5上。秋蠶豆的抗寒性高低決定幼苗能否順利越冬，Ahmed 和Regina（2016）鑒定出與秋蠶豆幼苗返青和脂肪酸含量相關的3 個RAPD 標記（F15_467、I10_661、E20_1556），為蠶豆抗霜凍品種培育提供了基因資源。Sallam 等（2016）通過QTL 定位和全基因組關聯(lián)分析，在101 個重組自交系和189 個不同基因型的單粒傳后代中檢測到1 個與抗凍相關基因緊密連鎖的SNP 標記（VF_Mt3g086600）。干旱是限制蠶豆產(chǎn)量的重要因素之一，其生殖生長期對水分虧缺相較其他食用豆類更加敏感（Xia，1994）。Khazaei等（2014）利用211 個蠶豆重組自交系，參考蒺藜苜蓿的SNP 在蠶豆中檢測到15 個與氣孔特性相關的QTL，將8 個抗旱候選基因定位在蠶豆的2 號染色體。

3 展望

隨著分子生物學的快速發(fā)展，蠶豆遺傳連鎖圖譜的飽和度增加明顯。然而分子標記的種類不多，其中，SSR、AFLP 和ISSR 等二代標記仍然是蠶豆遺傳圖譜構建和種質資源評價常用的標記技術。隨著蠶豆全基因組序列的發(fā)表，將會開發(fā)更多覆蓋全基因組的分子標記，對促進蠶豆分子遺傳學研究和種質創(chuàng)新有重要意義。

種質資源的遺傳多樣性是加速作物育種改良的重要物質基礎。由于沒有發(fā)現(xiàn)蠶豆的直系野生種，且種間雜交不成功，蠶豆種質創(chuàng)新進展較慢。然而我國蠶豆的種植區(qū)域較廣，在長期的隔離環(huán)境下不同生態(tài)類型的蠶豆資源形成了具有特殊遺傳背景的資源群體。因此，充分利用蠶豆地方品種中存在的具有特殊價值的變異類型，對改良蠶豆品種和創(chuàng)新種質具有重要意義。首先，今后應適當加大對國內(nèi)外蠶豆資源的引種力度，對具有代表性的種質資源進行系統(tǒng)分析和詳細比較研究。其次，將春蠶豆與秋蠶豆資源結合，根據(jù)市場多元化需求，培育適于機械化、品質優(yōu)良的加工型蠶豆新品種。再次，開發(fā)組學技術和新型分子標記輔助選擇的技術體系，構建蠶豆核心種質的分子信息庫，進行基因精細定位和功能研究，提高產(chǎn)量和抗性改良育種。