秦曉宇，張斌森，張笑佳，逯曉婷，劉鴻鑫，王春愛

1.730030 甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院

2.200120 上海市，同濟大學附屬東方醫(yī)院麻醉科

3.730030 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室

4.730030 甘肅省蘭州市，甘肅省中藥新產品創(chuàng)制工程實驗室

5.730030 甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院

6.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)院麻醉疼痛醫(yī)學中心

7.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中西醫(yī)結合麻醉臨床醫(yī)學研究中心

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種術后常見的神經系統并發(fā)癥。數據顯示，60 歲以上非心臟手術患者POCD 發(fā)生率高達56%，且隨年齡的增長逐漸增高［1-2］。POCD 嚴重影響了患者的術后康復和生活質量，增加了患者的經濟負擔以及疾病的發(fā)病率和死亡率［3］。目前，國際和國內多學科專家共識指出，降低POCD 發(fā)生的主要措施仍以圍手術期預防為主［4-5］。POCD 藥物治療本身存在不良反應，和麻醉藥物作用還可能增加手術風險。研究表明，電針對POCD 患者認知功能改善療效確切，且不良反應更少，成本更低［6］，然而具體機制尚不明確。鐵死亡是一種新發(fā)現的鐵依賴性程序性細胞死亡方式，參與誘導POCD 神經損傷并誘發(fā)炎癥反應［7］。炎癥是導致POCD 的重要病理因素，麻醉/手術后促炎和抗炎細胞因子大量表達，進一步加重神經元細胞死亡［8］。而能否通過電針抑制鐵死亡途徑及其調控促炎和抗炎細胞因子間的失衡進而減輕POCD 鮮有報道。因此，本研究以老年POCD 大鼠模型為研究對象，觀察電針百會、內關穴對術后學習記憶功能、促炎和抗炎細胞因子以及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 本研究時間為2022年1月—2023年2月。取18～20月齡SPF 級健康雌性SD 大鼠72 只，體質量350～450 g，由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（甘）2020-0001。飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食水，室內溫度22～24 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光/暗環(huán)境循環(huán)。本研究通過甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（2021-200）。

1.1.2 主要實驗儀器和耗材：針灸針（北京科苑達醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm），電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），醫(yī)用縫合針（杭州華威醫(yī)療用品有限公司），Morris 水迷宮系統（成都泰盟科技有限公司），離心機（德國Eppendorf 公司），酶標儀（美國Molecular 公司），搖床（美國SCILOGEX 公司），轉印槽（美國Bio-Rad 公司），透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.1.3 主要藥品和試劑：丙泊酚（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，貨號：國藥準字H20123138），大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）6、IL-10 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），鐵含量檢測試劑盒（美國Abcam 公司，貨號：ab83366），脂質過氧化物（lipid peroxidation，LPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：A106-1-2），?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1，FTH1）、GAPDH 抗體（美國Immunoway公司，貨號分別為：YT8070、ab75972、YM3029），溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab232958）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機數字表法分為3 組：對照組（n=24）、模型組（n=24）和電針組（n=24）。術后觀察大鼠并進行行為學檢測，根據術后3、7 d 兩個觀察時間點將每組大鼠分為2 個亞組（對照組術后3 d 亞組、對照組術后7 d 亞組，模型組術后3 d 亞組、模型組術后7 d 亞組，電針組術后3 d亞組、電針組術后7 d 亞組），每組12 只。

1.2.2 POCD 大鼠模型建立：參考文獻［9-10］的方法，采用剖腹探查手術建立POCD 模型。對照組捆綁固定和腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，其余組大鼠腹腔注射150 mg/kg 丙泊酚麻醉。待大鼠翻正反射消失、夾尾實驗無反應后，剔除腹部毛發(fā)，對擬進行手術部位碘伏消毒。用手術刀沿大鼠劍突下方約1 cm 處的腹部正中白線做約3 cm 切口，然后剪開大鼠腹肌和腹膜，暴露腹腔內臟。隨后按照肝臟、脾臟、胃、腸道、腎臟順序依次探查。每次探查時間為3 min，共探查3 次，間隔時間為7 min。在每次探查間隔時間內，從腹腔內取出約10 cm 的小腸，用0.9%氯化鈉溶液預浸泡的紗布覆蓋，用手指輕微搓揉腸管約3 min，然后將其送回腹腔。整個手術探查時間約為30 min。探查結束后，用4-0 手術縫線逐層縫合肌肉和皮膚，并用無菌輔料覆蓋腹部。Morris 水迷宮行為學檢測結果與對照組比較差異顯著，即為建模成功。

1.2.3 給電針組大鼠穿上自制鼠衣，然后繃帶捆綁固定。選取大鼠百會和雙側內關穴，取穴位置參照《實驗動物常用穴位名稱與定位 第2 部分：大鼠》［11］。一次性無菌針灸針在百會穴位置向后斜刺2 mm，內關穴位置直刺1 mm。在疏密波，20/100 Hz 頻率，1 mA 電流強度條件下刺激20～30 min。于造模前2 d 開始干預，1 次/d，連續(xù)5 d。對照組和模型組大鼠在電針組大鼠刺激期間做同樣捆綁固定。

1.2.4 實驗過程中4 只大鼠被排除，包括對照組術后3 d亞組1 只大鼠認知功能訓練過程中發(fā)現視物不清，模型組術后7 d 亞組、電針組術后3 d 亞組、電針組術后7 d亞組各1只大鼠造模后次日死亡。最終共納入68只大鼠。

1.2.5 Morris 水迷宮裝置檢測大鼠行為學表現：術前通過定位航行實驗對大鼠進行認知功能訓練，將大鼠頭朝池壁放入水中，記錄大鼠逃避潛伏期。若在120 s 內找到平臺，則平臺上停留10 s；若在120 s 內未找到平臺（潛伏期記為120 s），則引導至平臺上并停留15 s。訓練共歷時5 d，每天定于固定時間段訓練4 次（即分別將大鼠從不同象限放入水中），大鼠每兩次訓練時間間隔為15～20 min。于術后3、7 d 行定位航行實驗檢測（方法同上）。定位航行實驗結束后，撤出平臺，將大鼠于同一象限放入水中，行空間探索實驗。記錄120 s 內大鼠的游泳路徑和穿越原平臺位置次數。

1.2.6 行為學實驗完成后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠。待大鼠翻正反射、夾尾反應消失后打開腹腔，暴露腹主動脈，采用無菌采血管取血。將血液室溫下靜置30 min，于低溫離心機中3 000 r/min 離心15 min（離心半徑8 cm），取血清于凍存管中。然后斷頭取腦，于冰上迅速分離海馬組織。按照試劑盒說明書逐步操作。使用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），根據標準曲線計算血清、海馬樣品中IL-6、IL-10、TNF-α 的水平。每個亞組取5 只大鼠的海馬組織檢測IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.7 取大鼠海馬組織裂解勻漿，4℃，3 000 r/min 離心20 min（離心半徑8 cm），取上清液。應用組織鐵含量檢測試劑盒檢測海馬組織中Fe2+的濃度。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 取大鼠海馬組織，按照試劑盒說明書逐步操作，在586 nm 波長下通過酶標儀測定OD 值，計算各組大鼠LPO 相對含量。

1.2.9 免疫印跡法（Western blot）檢測海馬ACSL4、LPCAT3 和FTH1 蛋白表達水平：每組選取5 只大鼠，取海馬組織100 mg，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測定樣品蛋白濃度。根據目的蛋白分子量配置相應濃度分離膠。將樣品蛋白加入上樣孔中（量依據BCA濃度計算所得），以80 V 電壓開始電泳，待Marker散開后調至120 V。電泳后，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉120～150 min。加入稀釋好的一抗，4 ℃搖床孵育過夜。加TBST 稀釋好的二抗，室溫搖床孵育1.5 h。加入ECL 發(fā)光液，機器曝光成像，Image J 軟件中分析條帶灰度值。

1.2.10 透射電鏡觀察海馬區(qū)神經細胞超微結構：取灌注后的大鼠海馬組織，在2.5%戊二醛中固定過夜。經脫水、包埋后，將樣品切成超薄切片（厚度60～80 nm）。用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色。水洗，充分干燥后在透射電鏡下觀察細胞超微結構。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Dunn's 檢驗。術前不同時間認知功能訓練計量資料多組間比較采用雙因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學檢測結果

2.1.1 術后3 d、7 d 大鼠組別與時間對大鼠術前認知功能訓練逃避潛伏期均不存在交互作用（P交互＞0.05），訓練時間對逃避潛伏期主效應均顯著（P時間＜0.05），組別對逃避潛伏期主效應均不顯著（P組間＞0.05），見表1、表2。

表1 術后3 d 各亞組大鼠術前認知功能訓練逃避潛伏期比較（s）Table 1 Comparison of cognitive function training escape latency in 3 d postoperative subgroups

表2 術后7 d 各亞組大鼠術前認知功能訓練逃避潛伏期比較（s）Table 2 Comparison of cognitive function training escape latency in 7 d postoperative subgroups

2.1.2 術后3 d 各亞組逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后3 d 亞組逃避潛伏期高于對照組術后3 d亞組、電針組術后3 d 亞組，穿越平臺次數、目標象限停留時間低于對照組術后3 d亞組、電針組術后3 d亞組，電針組術后3 d 亞組穿越平臺次數低于對照組術后3 d亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。大鼠術后3 d 平均游泳速度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。術后7 d 各亞組逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留時間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后7 d 亞組逃避潛伏期高于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組，穿越平臺次數低于對照組術后7 d亞組，目標象限停留時間低于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組。大鼠術后7 d 平均游泳速度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表3 大鼠術后3 d 學習記憶情況比較Table 3 Comparison of learning and memory of rats in 3 d postoperative subgroups

表4 大鼠術后7 d 學習記憶情況比較Table 4 Comparison of learning and memory of rats in 7 d postoperative subgroups

2.2 大鼠術后炎癥反應情況

2.2.1 術后3 d 各亞組血清IL-6、TNF-α、IL-10 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術后3 d 亞組、電針組術后3 d 亞組，電針組術后3 d 亞組TNF-α 高于對照組術后3 d 亞組，IL-10 高于對照組術后3 d 亞組、模型組術后3 d 亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。術后7 d 各亞組血清IL-6、TNF-α、IL-10 含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后7 d亞組IL-6 高于對照組術后7 d 亞組，TNF-α 高于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組，電針組術后7 d亞組IL-10 高于對照組術后7 d 亞組、模型組術后7 d亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表5 術后3 d 各亞組大鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 5 Comparison of serum IL-6，TNF-α and IL-10 levels in 3 d postoperative subgroups

表6 術后7 d 各亞組大鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 6 Comparison of serum IL-6，TNF-α and IL-10 levels in 7 d postoperative subgroups

2.2.2 術后3 d 各亞組海馬IL-6、TNF-α、IL-10 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中模型組術后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術后3 d 亞組、電針組術后3 d 亞組，電針組術后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術后3 d 亞組，IL-10 高于對照組術后3 d 亞組、模型組術后3 d 亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表7。模型組術后7 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組，電針組術后7 d亞組IL-10 高于對照組術后7 d 亞組、模型組術后7 d亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表8。

表7 術后3 d 各亞組大鼠海馬IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 7 Comparison of IL-6，TNF-α and IL-10 levels in hippocampus in 3 d postoperative subgroups

表8 術后7 d 各亞組大鼠海馬IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 8 Comparison of IL-6，TNF-α and IL-10 levels in hippocampus in 7 d postoperative subgroups

2.3 大鼠術后鐵死亡指標的檢測結果

術后3 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后3 d 亞組Fe2+、LPO、ACSL4、LPCAT3 高于對照組術后3 d 亞組、電針組術后3 d 亞組，電針組術后3 d 亞組高于對照組術后3 d亞組，模型組術后3 d 亞組FTH1 低于對照組術后3 d亞組、電針組術后3 d 亞組，電針組術后3 d 亞組低于對照組術后3 d 亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表9。大鼠術后7 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組術后7 d 亞組Fe2+、LPO、ACSL4、LPCAT3 高于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組，FTH1 低于對照組術后7 d 亞組、電針組術后7 d 亞組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表10。術后3、7 d 各亞組大鼠ACSL4、FTH1 和LPCAT3蛋白條帶圖見圖1、圖2。

圖1 術后3 d 觀察亞組大鼠海馬ACSL4、FTH1 和LPCAT3 蛋白條帶圖Figure 1 The protein bands of ACSL4，FTH1 and LPCAT3 in 3 d postoperative subgroups

圖2 術后7 d 觀察亞組大鼠海馬ACSL4、FTH1 和LPCAT3 蛋白條帶圖Figure 2 The protein bands of ACSL4，FTH1 and LPCAT3 in 7 d postoperative subgroups

表10 術后7 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達水平比較Table 10 Comparison of relative expression levels of Fe2+，LPO，ACSL4，FTH1，and LPCAT3 in 7 d postoperative subgroups

2.4 大鼠術后海馬組織超微結構變化

對照組術后3 d、7 d 亞組海馬組織視野內細胞核形態(tài)規(guī)則、表面光滑，雙核膜結構清晰，核周隙正常，核內染色質未見凝集；胞質內部分線粒體自噬；內質網豐富，未見明顯擴張，見圖3A、圖3 d。模型組術后3、7 d 亞組海馬組織視野內細胞核雙核膜結構清晰，核周隙未見明顯增寬，形態(tài)不規(guī)則，表面凹凸不平；核內染色質濃縮邊集；胞質內少量線粒體膜破裂，膜結構消失；部分內質網明顯擴張；并可見部分髓鞘斷裂，排列紊亂，見圖3B、圖3E。電針組術后3、7 d 亞組海馬組織視野內細胞核形態(tài)規(guī)則，表面光滑，雙核膜結構清晰，核周隙未見明顯增寬，染色質分布較均勻；胞質內部分線粒體膜破裂，嵴結構消失或減少，基質電子密度降低呈空泡化，并可見少量線粒體自噬；部分內質網可見輕度擴張；并可見少量自噬體；胞質內還可見少量電子密度中等的均質性無界膜的脂滴，見圖3C、圖3F。

圖3 大鼠海馬組織超微結構Figure 3 Ultrastructure of rat hippocampal tissues

3 討論

POCD 患者主要癥狀包括術后精神錯亂、焦慮、人格改變以及記憶力和認知能力減退。其屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”“呆病”等范疇，病位在腦，與心肝脾腎緊密相關?！八铚p腦衰，神機失用”是其主要病機。因腎精不足、氣血虧虛或情志所傷，髓海失充，腦失所養(yǎng)；或瘀血、實邪痹阻腦絡，清竅失養(yǎng)，腦髓空虛而發(fā)?。?2］。

鐵死亡是近年來提出的一種以鐵依賴性LPO 和脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積為特點的新型細胞死亡方式，其發(fā)生主要是由于細胞鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統不平衡以及LPO 堆積導致的。Fe3+在鐵死亡過程中至關重要，鐵代謝紊亂會使Fe2+過多的累積在細胞內，Fe2+通過芬頓反應導致ROS 積累，引起細胞氧化應激損傷。FTH 是一種鐵載體蛋白，能夠將Fe3+轉運到細胞內，從而維持細胞內Fe3+的平衡，并具有鐵氧化酶活性，以防止鐵介導的ROS 產生［13］。研究表明，麻醉/手術后細胞或腦鐵含量顯著增加，FTH 表達下降，海馬神經元細胞活力下降，且伴隨著認知功能損傷［14-15］。LPO 積累是細胞發(fā)生鐵死亡的另一因素，需要多種關鍵酶的激活，如ACSL4 和LPCAT3［16］。ACSL4 是多不飽和脂肪酸代謝的重要同工酶，決定了細胞鐵死亡的敏感性。人神經母細胞瘤細胞經七氟醚處理后，胞內Fe2+和ACSL4 水平明顯升高；沉默ACSL4 能夠明顯抑制七氟醚誘導的細胞鐵死亡過程［17］。本研究發(fā)現，術后大鼠海馬Fe2+、ACSL4 和LPO 水平顯著升高，FTH1 水平顯著降低；且經電針處理后，海馬Fe2+、ACSL4 和LPO 水平顯著降低，FTH1 水平顯著升高，并伴隨著大鼠學習和記憶功能的改善。

線粒體結構和功能的改變亦是細胞發(fā)生鐵死亡的典型標志。在形態(tài)學上，主要表現為線粒體萎縮缺失、雙層膜密度增加、嵴減少或消失、外膜破裂等［18］。本研究通過透射電鏡觀察海馬超微結構變化，發(fā)現POCD 大鼠海馬神經元細胞胞質內線粒體膜破裂，膜結構消失，表明麻醉/手術創(chuàng)傷可導致老年大鼠海馬神經元鐵代謝紊亂、脂質代謝異常和線粒體結構改變，神經元細胞發(fā)生鐵死亡，進一步引起認知功能障礙；電針可通過神經元鐵死亡途徑緩解POCD。

麻醉/手術還會影響炎癥細胞因子表達水平。手術后手術部位炎癥細胞因子增加，大腦獨特的炎癥細胞（如小膠質細胞）響應促炎因子而被激活，并促進神經炎癥的進展［19］。IL-6 作為免疫系統中重要的信號分子，可以調節(jié)神經元和突觸功能，包括突觸傳遞和突觸可塑性，這是學習和記憶的重要細胞機制［20］。正常情況下，中樞神經系統中的IL-6 表達水平通常較低，但在一些與認知功能和行為學改變相關的中樞神經系統疾病中IL-6 表達水平則明顯升高［21］。促炎細胞因子TNF-α 在免疫和炎癥以及控制細胞增殖、分化和凋亡中亦起重要作用［22-23］。在炎癥反應中，誘導TNF-α可產生多種外源性和內源性信號，刺激其他炎癥細胞因子的產生，如IL-1、IL-6、IL-8、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、干擾素（interferon，IFN）和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β。IL-10 是一種細胞因子合成抑制因子（cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF），可調節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性和免疫反應。在炎癥和細胞死亡中起核心作用的促炎細胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 和IFN-γ 的表達均受IL-10 的免疫調節(jié)負向調控［24］。POCD 中樞神經炎癥假說認為，外周炎癥因子的變化可能影響中樞神經系統，隨后引起中樞神經系統炎癥反應。本研究發(fā)現，手術后大鼠血清和海馬炎性因子IL-6、IL-10 和TNF-α 水平明顯升高，促炎和抗炎細胞因子之間的失衡也是POCD 發(fā)展的一個重要病因機制。

電針是將針刺入穴位，并通過針引入電流，從而將電和針結合起來，以增強針刺的強度和效果［25］。本研究團隊前期通過系統評價的方法證實，電針可以有效緩解老年患者和胃腸道腫瘤切除患者術后認知功能損傷［6，26］。本研究選取百會和內關穴，設置參數為20/100 Hz 疏密波型，對大鼠進行圍術期5 d 的電針刺激，相關結果有效地降低了大鼠術后認知功能損傷。百會穴和內關穴是臨床實踐中電針預防POCD 最常選擇的兩個穴位。百會穴為督脈要穴，有疏散風寒、溫經通陽、升陽固脫、鎮(zhèn)驚息風、清熱開竅等作用，為回陽救逆之要穴；內關穴為八脈交會穴之一，手厥陰心包經之絡穴，針之可調和陰陽、理氣通脈、養(yǎng)心清腦、回陽救逆［27］。

綜上所述，神經元細胞鐵死亡和炎癥細胞因子之間的失衡可能是POCD 發(fā)生的重要機制，電針百會穴和內關穴可通過調控神經元細胞鐵死亡和炎癥細胞因子水平有效緩解POCD。本研究為電針改善POCD 提供了新的思路和方法，但電針的腦保護作用機制仍需要進一步驗證和更深入的研究。

作者貢獻：秦曉宇、王春愛負責選題，進行研究構思和設計；秦曉宇負責研究的實施和推進，數據收集、統計分析并起草了論文；秦曉宇、張斌森、張笑佳、逯曉婷、劉鴻鑫負責動物實驗、數據收集和數據整理；秦曉宇、張斌森、張笑佳負責實驗指標檢測；王春愛負責文章的質量控制和審查，對文章整體負責。

本文無利益沖突。